Aplicações da Proteômica em diversas
linhas de pesquisa na área Biomédica
Aplicações:
- Descoberta de novas drogas,
- Estudos em patologia,
- Diagnóstico,
- Terapias,
- Microbiologia,
- Bioquímica,
- Fisiologia de plantas,
- Controle de qualidade.
Abordagens em Proteômica
• Proteômica de Expressão
– Expressão Diferencial
• Proteômica Funcional
– Interação Proteina-Proteina
– Vias de Sinalização
– Modificação Pós- traducional
• Proteômica Quantitativa
REDE PROTEÔMICA DO RIO DE JANEIRO
LT
FIOCRUZ
2D
CONFIGURAÇÃO ATUAL - 2005
MALDI TOF -IBf
DBqMED
UFRJ
2D
LQPP
UENF
2D
MALDI TOF-TOF
IOC
Q-TOF - UENF
UMG
IBf-UFRJ
2D
Q-TOF - IBqM
LABIOS
IQ-UFRJ
2D
LBFP
UERJ
2D
BIOQ
UERJ
2D
2D
GEN
UFRJ
INCa
LABORATORIOS. ASSOCIADOS
RMN
ESPEC MASSA – PUC
AGROBIOLOGIA-EMBRAPA
BIOINFORMATICA
Caracterização de
proteínas
Análise proteômica comparativa de
diferentes extratos proteicos
isolados de cepas mutantes e
selvagem de C. glabrata
Penha, C. V. L., Bouchara, J. F., Lopes-Bezerra, L. M.
Candida glabrata
Maior obstáculo nas infecções por C. glabrata
resistência adquirida a terapias por azólicos
Espécies mais comuns causadoras da candidíase invasiva
Espécies
Frequência
Candida albicans
50%
Candida tropicalis
15-30%
Candida glabrata
15-30%
Candida parapsilosis
15-30%
Candida krusei
~1%
Candida lusitaniae
~1%
Potenciais mecanismos moleculares de resistência aos antifúngicos
Alterações no processamento intracelular do antifúngico
Modificação
Degradação
Alterações da enzima alvo
Mutação pontual
Superexpressão
Amplificação gênica
Conversão gênica ou recombinação mitótica
Alterações de outras enzimas na via da biossíntese do ergosterol
Bombas de efluxo
Transportadores ABC
“Major” Facilitadores
Objetivo
Contribuir para o entendimento
das prováveis modificações
envolvidas nas respostas
adaptativas dos fungos frente aos
medicamentos antifúngicos
Cepa 1085 S = selvagem
Cepa 178 = mutante, resistente a azolicos
Candida glabrata
Cepa 1085 S = selvagem
Cepa 178 = mutante, resistente a azolicos
Proteínas
Parede celular
Microssoma
Citoplasma
Candida glabrata
Cepa 1085 s = selvagem
Culturas
Cepa 178 = mutante
PMSF
EDTA
Pepstatina
RNAse
“
Bilhas de
vidro
’’
braun
Centrifugação:
2’ 500 g  eliminação das bilhas de vidro
5’ 1000 g  pellet - C1 = parede
30’ 12000 g  pellet - C2 = mitocôndria
60’ 75000 g  pellet - C3 = microssoma
Sobrenadante = proteínas do citosol C4
Solubilização de proteínas
C1
 C2
C3
“
’’
Sonificação - 3 ciclos de 15’
 Chaps
 Uréia
on
 DTT
Dosagem de Proteínas = Bradford
C1, C3 e C4
Eletroforese Bidimensional
(Strip 18 cm -Gel 12%)
A) 1085-S
 SDS
 IEF
100
Mr
(kDa)
250
150
100
37
37
25 
25 
3,0
11,0 pI
 IEF
 SDS
Mr
(kDa)
250
150
B) 1085-BET
3,0
11,0 pI
Two-dye overlay (1085-S/1085-BET)
Spots
1085-S
187
1085-BET
110
168
Matching
Spots
1085-S = azul
1085-BET= vermelho
Identificação por MALDI TOF/TOF
3,0
IEF
11,0
Piruvato decarboxilase
Fosfohexose isomerase
1 2 3 45 6
58
7
8 9
Enolase
10 11 12 13 14 15 16 17 61
63
57
24 62
18 19 20
21 22 23
25
56
60 59 30
31
43 44
40
45
28 29
36
47
37
42
48
50
49
52
51
53
54
Frutose 1,6 bifosfato aldolase
Gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase
34
41
46
27
35
33
32
38 39
26
55
“Expressão diferencial de proteínas da
parede celular de leveduras e conídios
do fungo dimórfico Sporothrix
schenkii”
In collaboration with the
Department of Cellular Biology and Genetics
UERJ
PREMISES
- etiological agent of feline and human sporotrichosis
- most common Latin America mycosis
- can affect tissues and internal organs
- dangerous to immunosupressed individuals
- morphological transition is a key factor in virulence
GOALS
- understand the physiopathology of disseminated
sporotrichosis
- identify virulence factors/ molecular biomarkers
2D-PAGE dos CWPs obtidos da parede
celular de diferentes formas do S. schenckii
kDa
190,0
120,0
60,0
50,0
40,0
25,0
15,0
3,0
IPG
10,0
3,0
IPG
10,0
Tabela 1- Quantificação das proteínas expressas (spots ) na parede celular da forma de levedura e de conídios
nos géis 2D, e sua distribuição percentual segundo os respectivo s pontos isoelétricos.
Morfologia
n  de spots
Percentual de proteí nas por faixa de pH a
pI 3,0 – 5,0
Levedura
233
Conídio
112
18,4%
29,5%
pI 5,0 – 7,0
pI 7,0 – 10,0
58,0%
23,6%
54,5%
16,0%
a - foram utilizadas tiras de focalização isoelétrica em gradiente de pH de 3,0 a 10,0.
Two-dye overlay (Levedura/Conídio)
4,0
IPG
SDS
A
7,0
N  de Spots
B
Lev
141
141
Con
32
32
Interseção
levedura - azul
conídio - vermelho
32
32
O QUE FOI ENCONTRADO UTILIZANDO PROTEÔMICA?
O QUE FOI ENCONTRADO UTILIZANDO PROTEÔMICA?
SÓ ISSO?!
Uma visão para o futuro....
produtos metabólicos
fragmentos gerados enzimáticamente
SELDI - Surface Enhanced Laser Desorption Ionization
Geração sistemática de anticorpos monoespecíficos
para explorar o proteoma humano.
- Análise de padrões de expressão protéica e localização subcelular;
- Investigação de vias de interação;
- Variantes resultantes de splicing;
- Modificações pós-traducionais.
> 400 genes humanos
100-150 aa consecutivos
PERSPECTIVAS
Conjunto de proteínas humanas não-redundantes (proteína representativa por
locus genético) estimado em 20 a 25 mil;
Produção de milhares de msAb possível por ano com essa nova técnica;
Previsão para completar o projeto em alguns anos.