Centro de Biologia
Molecular Estrutural
Universidade Federal de Santa Catarina
Departamento em Bioquímica
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Projeto REUNI: Integração de alunos de Graduação – Pós-graduação
“Como a Bioquímica auxilia na
descoberta de novas terapias”
Palestrantes:
•
Gabrielle do Amaral e Silva Muller: “Como a
proteômica pode auxiliar a identificar novos alvos
terapêuticos”
•
Priscila Graziela Alves Martins: “Inibição
enzimática como novo alvo para o tratamento de
doenças como tuberculose, diabetes e peste”
•
Tiago Bortolotto: “Como os ácidos nucléicos
(DNA e RNA) podem ser usados em terapias?”
Centro de Biologia
Molecular Estrutural
Universidade Federal de Santa Catarina
Departamento em Bioquímica
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Projeto REUNI: Integração de alunos de Graduação – Pós-graduação
Como a proteômica pode
auxiliar a identificar novos
alvos terapêuticos
Gabrielle do Amaral e Silva Muller
201007739
Florianópolis, 02 de junho de 2011
Proteoma
•
A palavra PROTEOMA refere-se as PROTEínas expressas por um genOMA.
•
Conceitualmente a proteômica engloba o somatório de todo o produto gênico, isto
é, todas as proteínas em uma célula ou organismo vivo.
•
Técnica que visa caracterizar processos biológicos e permitem a descrição de
mecanismos celulares.
DNA
Pré- RNAm
RNAm
Proteoma
Por que utilizar a proteômica
Moléculas biomarcadoras são utilizadas como uma importante ferramenta para
detecção e monitoramento e tratamento de doenças.
O status patológico de um indivíduo pode ser verificado por :
Genes alvos: presente em
células sadias e patogênicas.
Alterações na transcrição:
RNA muitas vezes é expresso,
porém não é traduzido.
Proteínas: refletem diretamente
se o individuo está com
determinada doença por meio
da interação ptn-anticorpo –
ELISA.
Na busca de novos alvos terapêuticos vem sido utilizada a proteômica, pois ela revela
proteínas biomarcadoras permitindo a identificação de indivíduos doentes X indivíduos
saudáveis.
Proteômica
• Em 2004, haviam 1619 artigos somente com pesquisas na área da
proteômica (hoje - 29564);
• Destes 192 artigos eram referente a proteômica clínica (hoje - 3702);
• E, 71 eram referentes a procura de moléculas biomarcadoras utilizando-se
a proteômica como ferramenta (hoje - 5247);
Câncer
• Diagnóstico: Próstata, mama, pâncreas, fígado, câncer de cabeça e nuca;
• Proteínas sinalizadoras são pouco abundantes em estágios iniciais;
• Falso negativo: indivíduos com câncer o exame negativo;
• Falso positivo: indivíduos sem câncer e exame positivo;
Proteína CA – 125 (Câncer ovariano): são positivos 50 % a 60%. É elevado endometriose
e gravidez;
National Cancer Institute
•
2006: Clinical Proteomic Technologies for Cancer (CPTC) foi fundada para acelerar o
desenvolvimento de tecnologias mais sofisticadas na busca de biomarcadores.
Proteômica
Vantagens proteômica
• Técnica relativamente barata;
• Rápida;
• Poderosa ferramenta na busca por
biomarcadores em fuidos e tecidos
humanos;
• Géis 2DE com espectrometria de massa e
a utilização de sofisticadas ferramentas de
bioinfomática são capazes de discriminar
estados iniciais da doenças, de tumores
belignos e malignos.
Desvantagens proteômica
•
Grande quantidade de proteína;
•
Não detecta proteínas pouco abundantes;
•
Durante a detecção pode ir outros tecidos
e isso pode resultar na diminuição da
precisão do método;
•
Antes de iniciar a busca por biomarcadores
é necessário
a padronização e
reprodutibilidade dos géis;
•
Comprovação em diversos laboratórios;
Proteômica
Proteômica
protéico de:
sistemática:
Tecidos
Células
Compartimentos celulares
mapa
Proteômica diferencial: faz análise das
modificações
a
nível
protéico
comparativamente com proteínas de
referência:
Desenvolvimento
Interações entre microorganismos e
hospedeiros
Tratamentos
Fluxograma das etapas experimentais
Extração da amostra
1. Não existe um método Universal;
2. Objetivo a serem visualizados no gel 2DE: Maior quantidade de proteína possível ou
somente um subgrupo de proteínas;
Tampão de lise
Solubilização
das ptns
Lise mecânica da
célula
Métodos de
ruptura celular
Gelo por 20 min
30´ a 1200 x g
Diversas
macromoléculas
Proteínas
Métodos de quantificações de proteínas
2D Quant Kit
Com base na concentração da curva
padrão da BSA.
Proteínas oriundas
da extração
480 nm
Bradford
Com base na concentração da curva
padrão da BSA.
545 nm
Limpeza das amostras
•
Fosfolipídios e ácido nucléicos: listras
horizontais;
•
Sal provoca alta condutividade na fita de
pH: pode provocar desidratação em
algumas porções do gel e hidratação em
outras.
•
Ácidos nucléicos: causam aumento da
viscosidade da amostra, aparecimento de
bandas adicionais, obstrui poros e liga-se a
proteínas.
•
Polissacarídeos: bloqueiam poros do gel,
aumenta o tempo de focalização;
•
Lipídeos: ligam-se a proteínas e diminuem
a mobilização das mesmas no gel.
Solubilização das proteínas
Agentes Caotrópicos: Uréia e Tiouréia
Agentes Surfactantes: CHAPS
Agentes redutores: DTT
Re-Hidratação da amostra em gradiente de pH
• Temperatura ambiente 25oC;
• Over night;
Tiras de strip com pH
imobilizado
Tampões-acrilamida
Gradiente
Faixa de pH
Linear
4,0-7,0
6,0- 11,0
3,0- 10,0
Não linear
3,0-10,0
Separação das proteínas em 1ª Dimensão
•
•
•
•
É um método eletroforético que separa as proteínas de acordo com seus pontos
isoelétricos;
Primeiro passo: escolha a faixa de pH ideal para a sua amostra;
Temperatura;
3500V a qual é mantida por até mils volts/hora;
Corrente elétrica
Separação das proteínas em 1ª Dimensão
Strips foram
removidos
Cerâmica IEF
Strips foram
posicionados
Ajuste dos
eletrodos
Total: 15500 V/h e
25 uA/strip
Ettan IPGphor 3
Paper Pads
umedecidos
Eletroforese em 2º Dimensão
É um método eletroforético que separa componentes de uma amostra de acordo
com o peso molecular. Esta técnica é realizada em gel de poliacrilamida contendo SDS.
12,5%
Preparação do gel em placas:
1. Homogêneo;
2. Concentração da acrilamida é graduada.
Separação 2º dimensão
Separação 1ª dimensão
Após coloração com
Coomassie Blue G-250
por 24h
Análise das imagens dos géis
Análise simultânea de diversas proteínas
 Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições
diferentes.
Análise das imagens no gel
Volume dos spots:
permitindo uma
quantificação relativa
Presença ou
Ausência de
spots
Posição dos spots (Ex. modificações pós-traducionais)
Digestão in-gel
Série de passos
Excisão dos
spots
Descoloração
Desidratação
tripsinização
Extração dos
peptídeos
Identificação das proteínas por espectrometria de massa
Espectrometria de massa é uma técnica que permite determinar a massa
molecular de proteínas/peptídeos e a seqüência de aminoácidos.
Esta informação é utilizada para identificar a proteína comparando bases de
dados de seqüência de nucleotídeos e de proteínas.
Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações póstraducionais das proteínas.
Sistema à vácuo
Amostras 2DE
Fonte de
ionização
Analisador
de massa
Detector
Identificação das proteínas por espectrometria de massa
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Obrigada!!