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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM
ZOOTECNIA
Disciplina: Seminário I
Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira
Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura
Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM
ZOOTECNIA
Abordagem Proteômica e a Identificação de
Biomarcadores de Processos Fisiológicos
Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira
Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura
Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas
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INTRODUÇÃO
Estrutural
Seres vivos
Enzimática
Transporte
Hormonal
Proteínas
Imunológica
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INTRODUÇÃO
Anderson & Anderson (1982)
ATLAS DAS PROTEÍNAS
HUMANAS
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Proteômica ou Proteoma (Wasinger et al. 1995)
A identificação e caracterização de
proteínas, constituintes de uma matriz
biológica (organismo, célula, organela,
fluído biológico) que são produzidas em
um determinado momento e sob
determinadas condições.
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Dinâmica do proteoma
Fatores epigenéticos
Temperatura
Estresse
Doenças
Alimentação
WITZMANN & LI (2002)
Transcrição
DNA
Splicing
pré-RNAm
RNAm
Modificações
Tradução
Proteínas
Degradações 7
OBJETIVOS DO ESTUDO DA PROTEÔMICA
Nível de expressão de
proteínas
Modificações Póstraducionais
Proteômica
Interações entre proteínas
Identificação de
Biomarcadores
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BIOMARCADORES
São moléculas biológicas indicadoras
de estados fisiológicos ou patológicos,
passíveis de serem mensuradas em
células e fluídos biológicos.
Moore et al., (2007)
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ABORDAGEM PROTEÔMICA E A
IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES
Coleta
Coleta
Amostra
Separação
Identificação
ZHOU et al., (2005)
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ABORDAGEM PROTEÔMICA E A
IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES
• Coleta de amostras:
– Unicelulares (+ sincronização):
• fase do ciclo celular e condições de cultivo
– Células e Tecidos de Organismos Pluricelulares
(- sincronização):
• Biópsias: ≠ tipos celulares
• Cultura de tecidos
– Coleta: Manual X microdissecção a laser
– Fluídos biológicos
• Complexidade
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ABORDAGEM PROTEÔMICA E A
IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES
• Eletroforese Bidimensional (2D)
Espectrometria de Massa (EM)
– Estudos fisiológicos ou patológicos comparativos;
• Quantitativos
• Qualitativos
• Cromatografia líquida (CL)
Espectrometria de massa (EM)
– Recuperação de ptns na forma nativa
• Análises funcionais, estruturais e bioquímicas
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
• Separação de misturas proteícas com base em
dois parâmetros físico-químicos: ponto
isoelétrico (pI) e a massa molecular (M.M.), sob
a influência de um campo elétrico:
– 1ª Etapa: Focalização Isoelétrica
• pI
– 2ª Etapa: Eletroforese descontínua em gel de
poliacrilamida + SDS (SDS-PAGE)
• Tamanho (massa molecular)
O’Farrell, 1975; Gorg et al. 1998
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
(+)
(maior)
M.M.
pI
(menor)
(-)
Focalização Isoelétrica
SDS-PAGE
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
(maior)
M.M.
(menor)
SDS-PAGE
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
(-)
(+)
pI
(+)
Revelação
• Azul brilhante de Coomassie coloidal
• Fluorescência
M.M.
Análise do gel
(-)
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
Gel A
controle
≠
Gel B
Tratamento
ISSAQ & VEENSTRA (2008) 17
ELETROFORESE DE FLUORESCÊNCIA
DIFERENCIAL EM GEL 2D (DIGE)
Cy5
controle
Cy5
Tratamento
UNLU et al., (1997); ISSAQ & VEENSTRA (2008)
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Tabela 1. Vantagens e limitações
eletroforese bidimensional.
Vantagens
Limitações
Quantificar expressão
Reprodutibilidade
Analisar modificações póstraducionais
Tempo de execução
da
Não é automatizada
Avaliar várias proteínas
Proteínas de membrana
Proteínas: pI e MM extremas
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL E
ESPECTROMETRIA DE MASSA
Digestão: tripsina
Espectrômetro de massas
m/z
Espectros de massas
Programas: identificar
a proteína
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ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Técnica analítica que identifica a composição
química de compostos, pela determinação de suas
massas moleculares na forma iônica, baseada na
sua movimentação (m/z) através de um campo
elétrico ou magnético.
Amostra
Fonte de
Ionização
Analisador
Detector
Dados
Recipiente com baixa pressão
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ESPECTROMETRIA DE MASSA
• Ionização por dessorção a laser assistida
por matriz -Tempo de vôo (MALDI-TOF)
Tempo de vôo
Detector
amostra
Karas & Hillkamp (1998)
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ESPECTROMETRIA DE MASSA
m/z
Espectrômetro de massa
Espectros de massas
peptídeos
Impressão Digital de peptídeos
Programas de Análise
e pesquisa em banco
de dados.
Proteína
Biomarcador
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
PERFORMANCE
Método de separação física baseado na
migração diferencial de compostos, devido a
suas distintas interações, entre duas fases
imiscíveis, a fase móvel (bombeada sob
pressão) e a fase estacionária (pequenas
partículas).
peptídeos
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
PERFORMANCE
• Fase líquida:
• Solvente: alto grau de pureza
• Fase estacionária:
Exclusão molecular
Poros com tamanhos controlados
Troca iônica
Altamente carregada (íons + ou -)
MATT et al. 2008
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SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
DE ALTA PERFORMANCE
Detector
Bomba de alta pressão
amostra
Reservatório fase
móvel
coletor
Registro e análise
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dos dados
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
PERFORMANCE
• Métodos de detecção:
– Absorbância (UV)
– Fluorescência
– Espectrometria de massa
• CLEM
proteínas
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CROMATOGRAFIA ASSOCIADA A
ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM
(ES/ES)
• Ionização por spray de elétrons –Tempo
de vôo em TANDEM (ESI-TOF/TOF)
Camara de colisão
m/z
MATT et al., 2008
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ESPECTROMETRIA DE MASSA (EM/EM)
Espectrômetro de massa
(EM/EM)
m/z
Espectros de massas
Sequenciamento de novo da proteína
Programas de Análise
e pesquisa em banco
de dados.
Proteína
Biomarcador
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Tabela 1. Vantagens e limitações da
cromatografia líquida de alta performance.
Vantagens
Limitações
Tempo de execução
Custo do equipamento
Automatização
Manutenção do equipamento
Versatilidade
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ABORDAGEM PROTEÔMICA E
IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES
Do geral para o particular
Analisar proteomas de condições
distintas e identificar as
diferenças
Do particular para o geral
Analisar uma proteína e inferir suas
funções no contexto do todo
Separação de proteínas nas amostras
Eletroforese bidimensional
Cromatografia líquida (LC)
fragmentação
Espectrometria de Massas:
Determinação de massas para identificação
Impressão digital de peptídeos
Sequenciamento de novo
Bioinformática
MANN et al. 2001
PROTEINA
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Identificação da bactenecina no muco
cervico-vaginal pela eletroforese-2D em um
modelo ovino de trabalho de parto
MS/MS
Indução de parto
Dexametasona
(+) Bactenecina
0h
28 h
Trabalho
de parto
YOUNG et al. (2007)
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Análise proteômica de proteínas hipotalâmicas
de linhagens de galinhas de alta e baixa
produção de ovos
corte
18
semanas
60
semanas
CLAPMS/MS
Ribonucleoproteína
nuclear heterôgenea H3
(HNRPH3)
poedeira
(HNRPH3) (+)
KUO et al. (2007)
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Proteína Osteopontina como
biomarcador de fertilidade em bovinos
AIDA et al. (1999)
Purificação
Sequenciamento
identificação
Alta fertilidade
Osteopontina
55 kDa; pI = 6,2
sêmen
FIV
Baixa fertilidade
oócitos
(+)
KILLIAN et al. (1993)
GONÇALVES et al. (2008)
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Desafios na Abordagem Proteômica e
Identificação Biomarcadores
• Otimização dos bancos de dados
• Detecção de proteínas em baixas
concentrações;
• Automatização das técnicas;
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Perspectivas da abordagem proteômica e
identificação de Biomarcadores
• Diagnóstico e prognóstico de doenças e
animais humanas e animais;
• Seleção de animais de produção;
• Descoberta de novos princípios da
fisiologia celular;
• “Metabolômica”;
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Rodrigo V. De Oliveira
[email protected]
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