PROTEÔMICA
13/11/2007
O que é Proteômica?
“Identificação, caracterização e quantificação de
todas as proteínas envolvidas em uma cadeia
particular, organela, célula, tecido, órgão ou
organismo que pode ser estudado com o
objetivo de fornecer dados confiáveis para o
entendimento de determinado sistema.”
A nomenclatura ômica…
Genômica
DNA (Gene)
Transcrição
Transcriptômica
RNA
Tradução
Genômica
Funcional
Proteômica
PROTEÍNA
Reação
enzimática
Metabolômica
METABOLITE
Lições sobre os Projetos genômicos

A complexidade evolucionária não é primariamente determinada
pelo maior número de genes, mas som pela variação do número
de proteínas sintetizadas.

Isso é alcançado pela geração de múltiplas proteínas a partir de
um único gene, como por exemplo:
 Diferentes combinações de exons por splicing alternativo

Processamento pós-traducional (ex, clivagem de pró-peptídeos)

Modificações pós-traducionais (ex acetilação, glicosilação)

Modificações no dogma central: DNA --> RNA --> proteína(s)

É importante então realisar análises a partir dos PRODUTOS do
gene, e não tanto dele mesmo.
Por que estudar a expressão de proteínas?
mRNA inativo
Controle
Degradação
RNA
DNA
Transcrito
de RNA
Primário
mRNA
mRNA
Controle de Tradução
Controle
Transcricional
Controle
do Proces
De RNA
Controle
Transport
RNA
proteína
Proteína
Controle
Pós-Transducional

Vantagens centrais da proteômica:

Pesquisadores trabalham no nível de produtos gênicos,
que são realmente expressos e levam a um produto
real, não somente sendo expresso e tendo mRNA.

Limitações centrais da proteômica:

Geralmente, somente uma fração das proteínas
sintetizadas pode ser detectada num experimento,
enquanto a expressão de todos os genes pode ser
monitorada num experimento de array.

Pré-requisito básico da proteômica:

O genoma sequenciado do organismo investigado ou
pelo menos uma coleção de cDNAs.
Background experimental

Eletroforese 2D



Método para separação e visualização de
proteínas
SEparação por carga e massa
Espectometria de Massa



Análise de alta confiabilidade e identificação de
proteínas.
Fragmentação de proteínas
Análise de peptídeos
2D-SDS PAGE gel
A primeira dimensão
(separação por ponto isoelétrico)
- Gel com um gradiente de pH
imobilizado
- Corrente elétrica leva aproteínas
carregadas a mover até alcançar o
ponto isoelétrico
Ponto Isoelétrico (pI)

Separação por carga:
4
Gradiente de pH estável
5
Baixo pH:
Proteína
Carregada
+
6
7
8
Alto pH:
9
Proteína
carregada
10
-
No ponto
isoelétrico, a
proteína não
tem carga e
portanto não
migra mais no
campo elétrico.
2D-SDS PAGE gel
A primeira dimensão
(separação por ponto isoelétrico)
- Gel com um gradiente de pH
imobilizado
- Corrente elétrica leva aproteínas
carregadas a mover até alcançar o
ponto isoelétrico
A segunda dimensão
(separação por massa)
-pH gel strip e colocado em um gel
SDS
-SDS desnatura a proteína
(movimento somente devido a massa)
e elimina carga.
2D-SDS PAGE gel
Exemplo de técnica de 2D-gel
Vantagens vs Desvantagens


Boa resolução para
proteínas
Detecção de
modificações póstranscricionais




Não funciona bem para
proteínas altamente
hidrofóbicas
Limitado pelo range de
pH
Difícil detecção de
proteínas pouco
abundantes
Análise e quantificação
sáo difíceis
Background Experimental
Espectometria de Massas
O que é Mass Spec?

Ferramenta analítica para determinar a composição
molecular de uma amostra ou os pesos moleculares

Somente picomolares de concentrações são
requeridas

Acurácia de 0.01%, com somente 5 ppm de
pequenas moléculas orgânicas

Para 40 kDa, erro de 4 Da

Pode-se identificar substituições de aminoácidos ou
modificações pós-traducionais
Que tipo de informação é gerada?

Informação estrutural

Tandem mass spectrometers – particularmente,
uma sequencia definida

Fragmentação de amostra – análise de produtos

Sequenciamento de peptídeos

Identificação de compostos individuais em misturas
complexas
Como funciona um espectômetro?

3 partes fundamentais: fonte de ionização, o
analisador e o detector

Amostras fáceis de manipular se ionizadas

Separação no analisador de acordo com a razão
massa-carga (m/z)

Detecção de íons em separado e abundância relativa

Sinais enviados ao sistema de dados e apresentados
em um espectro m/z
Esquematização

O analisador, o detector e o ionizador estão em vácuo, para
evitar movimento indesejado de íons

A operação está sob completo controle de sistema
Esquema típico de um TOF-MS
Introdução da amostra e Ionização

Ionização direta ou via cromatografia
para separação de componentes (HPLC,
GC, eletroforese capilar)


Ionização pode resultar em íons
positivamente carregados (proteínas) ou
negativamente carregados (sacarídeos e
oligonucleotídeos)
Metodologias de Ionização








Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI)
Chemical Ionisation (CI)
Electron Impact (EI)
Electrospray Ionisation (ESI)
Fast Atom Bombardment (FAB)
Field Desorption / Field Ionisation (FD/FI)
Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
(MALDI)
Thermospray Ionisation
Detecção dos Íons

O detector monitora o íon, amplifica seu sinal
e o transmite para o sistema

Detectores comuns: photomultiplier, electron
multiplier, micro-channel plate
Espectometria de massas é uma metodologia
poderosa para analisar a estrutura de
compostos orgânicos, mas tem algumas
limitações:
Nada pode ser caracterisado se não estiver em uma
solução DEVIDAMENTE LIMPA
A técnica não tem abilidade de apresentar uma análise
seletiva de uma mistura complexa
Para moléculas grandes, resultados são difíceis de
interpretar.
Tandem MS ou MS/MS tem 2 mass spec em série:
O primeiro (MS1) é usado para selecionar, de uma fonte primária
de íons, aqueles que possuem um m/z particular, o qual passa
para a região de fragmentação, onde ocorrerá a dissociação. No
segundo (MS2), haverá a análise dos íons gerados. DE verdade,
MS1 é uma fonte de íons para MS2.
MS1
MS2
Sequenciamento de peptídeos

Peptídeos de 2.5 kDa ou menos dão melhores resultados.

Proteínas retiradas de géis 2-D e digeridas

Peptídeos fragmentados nas ligações peptídicas na Tandem
mass spectrometry

Alguns peptídeos geram informações para uma sequencia
completa, enquanto a maioria gera sequencias parciais de 4-5
aa

Geralmente essas “tag” sequences são suficientes para
identificação por database
Identificação de proteínas por MS
Library
Spot removed
from gel
Artificial
spectra built
Fragmented
using trypsin
Spectrum of
fragments
generated
MATCH
Artificially
trypsinated
Database of
sequences
(i.e. SwissProt)
Como funciona o sequenciamento de
proteínas




Tandem MS: dois analisadores de massa
em série com uma célula de colisão no
meio
Célula de colisão: um local aonde os
íons colidem com um gás (He, Ne, Ar)
resultando em fragmentação do íon
Ser-Glu-Leu-Ile-Arg-Trp
Collision Cell
A fragmentação dos petídeos na células
de colisão ocorre de maneira predizível,
principalmente nas ligações peptídicas
Ser-Glu-Leu-Ile-Arg
Os íons resultantes tem massas que são
consistentes com uma database de pesos
moleculares de dipeptídeos, tripeptídeos,
tetrapeptídeos...
Ser-Glu-Leu
Ser-Glu-Leu-Ile
Etc…
Vantagens vs. Desvantagens



Determinação de
peso molecular e
sequencia de aa.
Detecção de
modificações póstranscricionais
Alta confiabilidade


Alto custo
Requer sequencia de
peptídeos em
databse
Após a proteômica…..
Genômica funcional
ProteinChipTM.
Limitações da Proteômica
Limitações experimentais:
Análise em larga escala de proteínas pode ser
difícil devido a alguns problemas, como:
-Proteínas são frágeis
-Podem existir em múltiplas isoformas
-Não há equivalente para proteína de um PCR
para amplificação em larga escala
Limitações na análise de dados:
-Dados as vezes contêm muito ruído, que podem
ser difíceis de separar dos sinais específicos.
Pode resultar em gasto de tempo desnecessário
analisando espectros não importantes.
-As análises de banco de dados para os
espectros de mass spec são somente SCORES,
deixando a análise para intervenção manual para
eliminação de falsos positivos.
Limitações biomédicas:
-Na prática é muito difícil de traçar a completa
progressão da doença.
-As vezes, usar proteômica para monitorar a
bioquímica de uma doença é como usar uma
câmera fotográfica para filmar jogo de futebol






Explains the whole process nicely -- article
http://swehsc.pharmacy.arizona.edu/analysis/Proteomics_New
s.htm
Mascot Home page -- help section
http://www.matrixscience.com/help_index.html
Presentation about MS MS data
http://sashimi.sourceforge.net/extra/oral.pdf
http://www.genetik.unibielefeld.de/D1E33C76A7CCA010AAD3B435B51404EE/Geno
me_Research_WS2002_03/stunde_ws0203_10.pd
http://bmbus6.leeds.ac.uk/mres/5130/MassSpectrometry.ppt
Some info about drug discovery/economic issues n such:
http://monod.uwaterloo.ca/cs798/proteomics.pdf
Paper on interpreting MSMS data
http://chem-ncms.unl.edu/asms2003/kurt.pdf
How to estimate correctness of MS MS prediction -- EM !!!
http://www.proteomecenter.org/PDFs/Keller.AnalChem.02.pdf

http://www.nature.com/cgitaf/DynaPage.taf?file=/nbt/journal/v21/n3/full/nbt0303-221.html

http://www.esainc.com/MolecularProteomics/molecular_proteomic
s.htm
http://genome.ucsd.edu/classes/be202/ppt/11
Internet sites

www.astbury.leeds.ac.uk/Facil/MStut/mstutorial.htm
(Dr Alison E. Ashcroft at Leeds)





www.asms.org (The American Society for Mass Spectroscopy)
www.spectroscopynow.com (Base Peak)
Mass Spec tools
www.expasy.ch/tools/#proteome
http://prowl.rockefeller.edu
www.mann.embl-heidelberg.de
Bibliography
Internet sites :
 http://www.google.com
•
•
•
•
•
•
http://www.bmss.org.uk/what_is/whatis.html
http://www.duke.edu/~mdfeezor/NSHome/inform/msms1.html
http://www.astbury.leeds.ac.uk/Facil/MStut/mstutorial.htm
http://ms.mc.vanderbilt.edu/tutorials/ms/3.htm
http://www.garvan.unsw.edu.au/public/corthals/book/IPMS.html
http://www.micromass.co.uk/basics/Glossary.html
Metodologias de Ionização
Further Reading
1. MALDI beginner:
http://www.srsmaldi.com/Maldi/Guide.html
2.MALDI lab user:
http://www.srsmaldi.com/Maldi/Lab.html
3. MALDI tutorial:
http://ms.mc.vanderbilt.edu/tutorials/maldi/maldi-ie_files/frame.htm
4. Ionization Methods 1:
http://www.jeol.com/ms/docs/ionize.html
5. Ionization Methods 2:
http://www.waters.com/Waters_Website/Applications/lcms/lcms_itq.htm