Design de Primers..
Serve como um ponto de
partida para a replicação de
DNA. A DNA polimerase não
é capaz de iniciar a síntese
de uma nova cadeia de DNA
a partir de zero, podendo
apenas adicionar a uma
cadeia
de
nucleotídeos
existentes.
Primers determinam o sucesso de uma PCR!
Specificity?
Proper
annealing to
the template?
Comprimento do Primer
Determina especificidade e afeta seu
anelamento com o DNA molde!
• Muito curto -> baixa especificidade, resultando em amplificação
não específica
• Muito longo -> diminui a eficiência de ligação ao DNA molde em
temperatura normal de anelamento devido à maior
probabilidade de formação de estruturas secundárias, como
grampos.
• Comprimento ideal:
18-24
bp para PCR comum
30-35 bp para PCR multiplex
Tamanho do amplicon


150-1000 bp para PCR comum, evitar >3 kb
50-150 bp para qPCR, evitar >400 bp
Evitar amplicons muito curtos para poder distingui-los
de possíveis dímeros de primers!

Temperatura de melting (Tm)
A temperatura na qual 50% da dupla fita de
DNA se dissocia para fita simples.
• Determinado pelo comprimento, composição
de base e concentração dos primers e pela
concentração de sal no PCR mix
• Cálculo aproximado: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) °C (indicado para <18mer)
• Utilizado para cálcular a temperatura de anelamento (Ta):
Ta Opt = 0.3 x(Tm of primer) + 0.7 x(Tm of PCR product) – 25
• Regra geral: Ta = Tm-5°C
Temperatura de anelamento (Ta)
Ta ótima
• 52°C - 60°C
• Ta baixo aumenta a eficiência da PCR mas diminui a especificidade
• Ta alto aumenta a especificidade mas diminui eficiência da PCR.
• Ta >65°C pode ser recomendado para a amplificação de alvos com
elevado conteúdo de GC.
Diferenças de Ta entre o par de primers
• Incompatibilidade significativa do par de primers pode levar à má
amplificação
• Desejável diferença Ta <5°C
Para determinar a Ta ótima sempre testar os primers pela 1ª vez em
pelo menos 3 diferentes temperaturas (ex. a Ta indicada pelo
fabricante ou calculada +/- 2°C) e correr gel!
Escolher a máxima temperatura em que há apenas 1 banda (e do tamanho
esperado!) e a amplificação ainda é satisfatoria!
Especificidade e homologia cruzada
Especificidade
• Determinada principalmente pelo comprimento do primer assim
como sua sequência
• A adequação da especificidade do primer é relativo à natureza do
DNA molde utilizado na reação de PCR.
Homologia Cruzada
• Pode ser um problema quando o molde de PCR é o DNA genômico ou
consiste de fragmentos de genes mistos.
• Os iniciadores contendo a sequência altamente repetitiva são
propensos a gerar produtos de amplificação não específicos, quando
a amplificação de DNA genômico.
Para evitar amplificação não específica..
Além da temperatura e comprimento ideal dos primers:
• BLAST dos iniciadores contra banco de dados NCBI de sequência
não-redundante é uma maneira comum de evitar projetar primers
que podem amplificar regiões homólogas inespecíficas.
• Para PCR: Iniciadores que flanqueiam a junção intron-exon, para
evitar a amplificação não-específica devido à contaminação por
cDNA.
• Para qPCR: Iniciadores que flanqueiam a junção exon-exon para
evitar amplificação inespecífica devido à contaminação por gDNA.
Conteúdo CG e repetições
Conteúdo G/C do Primer
• Conteúdo ideal de G/C: 45-55%
• Conteúdo semelhante para o par de primers
• Recomendado C ou G na extremidade 3’ (aumentar eficiência ligação)
Runs (streches de base única, ex aaaaaaa)
• Repetições longas aumenta o potencial de anelamento inespecífico
• O número máximo aceitável de repetições é de 4 bp
Repetições (streches de di-nucleotídeos
consecutiva, ex. acacacac)
• Repetições aumenta o potencial de
anelamento incorreto/inespecífico
• O número máximo de repetições aceitável
é de 4 di-nucleotídeos
Complementaridade - Estruturas 2árias dos primers
• Atrapalham a ligação primer-molde,
levando a pouca ou nenhuma
amplificação
• Análise de ΔG aceitável (energia livre
necessária para quebrar a estrutura)
Grampos
• Formados por interações intra-moleculares
no mesmo primer
Auto-dímero (homodímero)
• Formado por interações inter-moleculares
entre dois iniciadores iguais
Cross-dímero (heterodímero)
• Formado por interações inter-moleculares
entre os primers sense e antisense
Softwares..
Primer3 (gratuito)
Primer BLAST (NCBI) – importante principalmente para fazer scan genômico
e avaliar possíveis anelamentos inespespecíficos