Biologia Celular e Molecular 2005/2006
Polymerase Chain Reaction
Trabalho realizado por:
Alexandre Sarmento
Ana Catarina Gomes
Ana Filipa Côrte
Ana Filipa Lima
Ana Sofia Sampaio
Rita Cardona
PCR – Como tudo começou…
• Dezembro de 1983
A sua ideia: desenvolver um processo com
o qual o DNA poderia ser multiplicado
artificialmente através de ciclos repetidos de
duplicação catalisada pela DNA polimerase
Kary Mullis
Thomas D. Brock no lago do “Yellowstone National Park”
de onde foi isolado o Thermus aqquaticus
• 10 anos mais tarde…
Ganhou o prémio Nobel
da Química!
• Qual é o objectivo?
Produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de
DNA a partir de uma quantidade mínima
• Quais os componentes?
Mg2+
DNA
Polimerase
dNTP
Primers
• Quais os instrumentos?
Termomixer
Termociclador
Eppendorfs
Influência dos componentes na
reacção de PCR
 DNA molde: deve estar livre de impurezas uma vez que estas podem inibir a reacção de
PCR
 Solução tampão
•
•
•
•
Tris: mantém o pH da solução
Iões monovalentes: K+, Na+ e NH4+ optimizam as condições da reacção
Soro de albumina de bovino: actua como proteína estabilizadora
Ião Magnésio:
- Baixa concentração: pouco ou nenhum produto
- Elevada concentração: baixa especificidade.
 Primers
• Baixa concentração: induz má polimerização
• Elevada concentração: induz o aparecimento de produtos
inespecíficos e formação de dímeros de primers
 Nucleótideos (dNTPs)
• Baixa concentração: maior especificidade, com pouco produto final.
• Elevada concentração: há aumento da quantidade de produto com perda de
especificidade.
 DNA polimerase
• DNA polimerase de Thermus aqquaticus (Taq polimerase)
- Termoestável e sem actividade exonucleotídea 3’- 5’,
ou seja, não tem actividade correctiva
•
DNA polimerase de Pyrococcus furiosus (Pfu)
- Termorresistente e com actividade exonucleotídea 3’-5’,
ou seja, tem actividade correctiva
In vitro e a cores…
Vantagens
•
Rapidez e facilidade na utilização: devido ao uso do “thermal cycler” e à
síntese dos primers simplificada pelo uso do software dos computadores;
•
Sensibilidade: o PCR é capaz de amplificar uma sequência de DNA
correspondente a uma única célula;
•
Robustez: o PCR permite a amplificação de sequências específicas de
material cujo DNA está degradado ou embutido num meio do qual o
isolamento do DNA é difícil.
Limites
•
É necessária informação prévia da região de interesse
•
O rendimento da técnica de PCR fica muito aquém do seu potencial
máximo:
– Qualidade do DNA molde : contaminantes
incluídos na amostra podem inibir a reacção
– Indisponibilidade de DNA devido a falhas/rupturas DNA ao dissociar-se
de outras macromoléculas durante a purificação
– Diminuição da actividade
da Taq polimerase ou a sua saturação
– Competição entre o produto obtido por PCR e os
primers na ligação ao fragmento DNA a amplificar
Limites
• Taq polimerase não possui actividade de exonuclease no sentido 3’→ 5’ e
por isso ocorrem erros (1 em cada 10000 pb);
• A utilização de “primers degenerados” diminui a sua especificidade podendo
a sequência amplificada não corresponder a sequência de interesse;
RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase
Chain Reaction)
• A amostra fornece o RNAm, que é convertido em cDNA
• Composta por 2 etapas:
transcrição reversa - síntese de uma cadeia de
DNA, utilizando-se como molde uma cadeia de RNAm,
numa reacção catalisada por uma transcriptase
reversa. São utilizados primers de oligonucleotídeos
compostos por várias timinas consecutivas (6 a 35),
complementares às regiões Poly-A do RNAm
amplificação
• A avaliação do RNAm permite detectar quais as proteínas
que estão a ser efectivamente expressas
Multiplex PCR
• Mais de um segmento genómico é amplificado
numa única reacção, cada um com o seu par de
primers específico
• Permite simplificar algumas experiências, como
a investigação de paternidade, onde vários
marcadores genómicos devem ser analisados,
reduzindo o tempo, trabalho e custo da
genotipagem
• Aplicada em análises de delecção, mutações e
polimorfismos
Nested PCR
•
Composta por duas etapas:
 1ª etapa – amplificação do DNA alvo.
A complementaridade dos primers a
locais alternativos, para alem do
pretendido, implica obtenção de
produtos não desejados
 2ª etapa – o produto da 1º etapa
submete-se a uma segunda reacção,
com novos primers. É muito
improvável que alguns dos produtos
não desejados contenham os locais
pretendidos para ambos os primers
novos,
assegurando
a
pouca
contaminação do produto da segunda
etapa
•
Aumentar a sensibilidade e especificidade
do método
PCR Competitiva
• Além do DNA molde, é adicionado à reacção um outro segmento de DNA, de sequência,
tamanho e concentração conhecidos (controlo), cujas extremidades são também
complementares dos primers que irão amplificar a sequência-alvo
• A amplificação do segmento controlo, tendo em conta a quantidade inicial e dados sobre
a eficácia da reacção, serve de padrão para a quantificação do DNA alvo
• Esta técnica é utilizada principalmente em kits diagnósticos (ex: carga viral de HIV)
Construção de um fragmento
controlo
• Enzima de restrição corta dois fragmentos de DNA: o do gene SDF-1α (alvo) e o do
gene da β-actina
• Os fragmentos das bordas de SDF-1α são unidos com o interior do fragmento
da β-actina
híbrido de tamanho maior, amplificável pelos primers específicos de
SDF-1α.
• Este híbrido é adicionado na reacção em quantidades pré-determinadas,
Real Time PCR
•
Utiliza primers e dNTP`s marcados por compostos fluorescentes
•
Termocicladores utilizados além de realizar os ciclos de temperatura, possuem
leitores de fluorescência que fornecem dados sobre a quantidade de DNA formada
durante a reação.
•
Permite a detecção da fluorescência emitida durante a reacção como indicador do
produto amplificado em cada ciclo da PCR (em tempo real)
Aumento da
fluorescência
Ciclos de PCR
Qual a sua utilidade?
•
Genetic fingerprinting
Técnica forense, na qual pequenas amostras de DNA
retiradas da cena de um crime são amplificadas para
serem analisadas
•
Testes de paternidade
Relações genéticas podem ser determinadas através de dois
ou mais DNA fingerprints, que por sua vez podem ser usadas
nos testes de paternidade
Electroforese de fragmentos de DNA amplificados por PCR
(1) Pai. (2) Criança (3) Mãe
•
Mutações
Há situações nas quais se está interessado em fazer cópias de DNA mutado, por
exemplo, ao tentar avaliar a função de um determinado gene ou na evolução in-vitro de
uma proteina
•
Doenças virais
Podem ser detectadas usando PCR, através da amplificação do DNA viral. Esta análise é
possível depois de uma infecção, que pode ocorrer muitos dias ou até muitos meses
antes dos sintomas ocorrer. Um diagnóstico precoce oferece aos médicos um avanço
significativo no tratamento
•
Análise de DNA antigo
DNA de um fóssil pode ser amplificado por PCR. Investigações
têm tido sucesso em amplificar material genético de insectos
fossilizados em amber que estão extintos há mais de 20 milhões
de anos
•
Detecção de doenças hereditárias
Um determinado gene pode ser amplificado com PCR usando os primers
apropriados e então ser arranjado em sequência para detectar mutações.
•
Clonagem de genes
Assentam no isolamento de um gene de um organismo e a sua inserção noutro
organismo.
Clonagem de um gene usando um plasmídeo.
(1) DNA cromossomal do organismo A. (2) PCR. (3) Multiplas cópias de um único gene
do organismo A. (4)Inserção do gene no plasmídeo. (5) Plasmídeo com o gene do
organismo A. (6) Inserção do plasmídeo no organismo B. (7)Multiplicação ou expressão
do gene, originalmente do organismo A, ocorrendo agora no organismo B.
Antes, procurar o segmento pretendido na amostra…
… era igual a encontrar uma agulha no palheiro
Actualmente, com a técnica de PCR…
… procurar o segmento pretendido na amostra
…é igual a encontrar várias agulhas num só palheiro
Agradecimentos
• Professora Doutora Delminda Neves
Referências
•
•
•
www.bio.davidson.edu/Courses/immunology/Flash/RT_PCR.html
www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html
www.pt.wikipedia.org
Molina, A. L., Tobo P. R., Uso das técnicas de biologia molecular
para diagnóstico, Einstein, 139-142
http://pt.wikipedia.org
www.etall.hpg.com.br: Vieira D. P., Técnicas de PCR: Aplicações e
Padronização de Reações
Maurizio Provenzano, MD, et tal, 2001, Scientific communication, 88-91