XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
Genotipagem do Papilomavírus Bovino (BPV-1) em amostras de DNA de Bovinos do Estado de
Sergipe1
Genotyping of Bovine Papillomavirus (BPV-1) in bovine DNA samples of the State of Sergipe
1° Denise Stéphanie de Almeida Ferreira2, 2° Victor Vasconcelos Costa3, 3° Erinaldo Ubirajara Damasceno
dos Santos4, 4° Sérgio Ferreira de Lima Júnior5, 5° Roniery Carlos Gonçalves Galindo 6, 6°Martin Alejandro
Montes7, 7° Paulo Roberto Eleutério de Souza8 e 8° Maria de Mascena Diniz Maia9
1
Parte do Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC), financiada por CNPq/Capes
Graduanda em Zootecnia – UFRPE, Recife e Pernambuco, Brasil. Bolsista CNPq/Capes.
e-mail: [email protected]
3
Graduando em Zootecnia –UFRPE, Recife e Pernambuco, Brasil. Bolsista CNPq/Capes
4
Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal Tropical – UFRPE, Recife e Pernambuco,
Brasil
5
Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Biologia Aplicada à Saúde – UFPE, Recife e Pernambuco,
Brasil
6
Associação de Ensino e Cultura Pio X – FACULDADE PIO DÉCIMO, Aracaju e Sergipe, Brasil
7
Laboratório de Genética, Bioquímica e Sequenciamento de DNA Profª. Tânia Falcão – UFRPE, Recife e
Pernambuco, Brasil
8
Laboratório de Genética, Bioquímica e Sequenciamento de DNA Profª. Tânia Falcão – UFRPE, Recife e
Pernambuco, Brasil
9
Departamento de Biologia, Área de Genética – UFRPE, Recife e Pernambuco, Brasil
2
Resumo: Atualmente, o Brasil detém a segunda maior população bovina comercial do mundo, contudo,
alguns fatores, dentre os quais as doenças infecto-contagiosas, afetam a produtividade desses rebanhos. A
infecção pelo papilomavírus bovino (BPV) causa lesões no epitélio cutâneo dos animais e possui alta
incidência na região Nordeste, gerando grandes perdas econômicas para os criadores. O objetivo do presente
estudo foi identificar a presença de DNA do BPV-1 em amostras de bovinos oriundos de rebanhos do estado
de Sergipe. Foram selecionadas 100 amostras de sangue total de bovinos, armazenadas no Laboratório de
Genética, Bioquímica e Sequenciamento de DNA, Professora Tânia Falcão (LGBS) – GENOMA, da
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE). A detecção da infecção se deu através da reação em
cadeia da polimerase (PCR). Inicialmente, realizou-se amplificação com os primers degenerados FAP59 e
FAP64 relativos à região do gene L1 do BPV. Em seguida, novas reações de PCR foram realizadas para
identificação de BPV do tipo 1. Os resultados mostraram uma prevalência de 68% (68/100) da infecção pelo
BPV nas amostras analisadas até o momento. Contudo, faz-se necessário a detecção do vírus em um maior
número de animais para uma real prevalência da infecção no Estado de Sergipe.
Palavras–chave: doenças infecto-contagiosas, infecção, genética, rebanhos, PCR
Abstract: Currently, Brazil has the second largest commercial cattle population in the world, however, some
factors, among which infectious diseases, affect the productivity of these herds. The infection with bovine
papillomavirus (BPV) damages the skin epithelium of animals and is highly prevalent in the Northeast,
causing huge economic losses to farmers. The aim of this study was to identify the presence of BPV-1 DNA
in bovine samples coming from Sergipe State herds. A hundred whole blood samples of cattle were selected,
stored in the Laboratory of Genetics, Biochemistry and DNA Sequencing, Teacher Tânia Falcão (LGBS) Genome, Federal Rural University of Pernambuco (UFRPE). The detection of infection occurred through the
polymerase chain reaction (PCR). Initially amplification was performed with primers FAP59 and FAP64
relative to the region of BPV L1 gene. Then, new PCR reactions were performed to identify the type BPV-1.
The detection reaction was performed by UV analysis after electrophoretic separation of DNA in agarose gel
1% stained with Syber Green dye. The results showed a prevalence of 68% (68/100) of BPV infection in
samples analyzed to date. However, the virus detection it is necessary in a larger number of animals in a real
incidence of infection in the State of Sergipe.
Keywords: infectious diseases, infection, genetics, herds, PCR
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Introdução
Os papilomavírus (PV) constituem um grupo diversificado de vírus de natureza fibroepitelial da
família Papovaviridae, que infectam mamíferos, aves e repteis (FREITAS et al., 2011). São caracterizados
por serem espécie-específicos e não infectarem outro hospedeiro que não seja o seu correspondente mesmo
quando submetidos a condições experimentais (CAMPO, 2006). Aos poucos, infecções cruzadas envolvendo
PV descrito na literatura estão relacionadas com o papilomavírus bovino (BPV) e outras espécies animais
(FREITAS et al., 2007).
A papilomatose bovina (PB) é uma doença que provoca o desenvolvimento de tumores (verrugas,
papilomas), sendo caracterizada por modificações na pele, nas mucosas e alguns órgãos, infectando células
basais do epitélio e formando projeções digitiformes, ou seja, em forma de dedo de luva, microscópicas ou
macroscópicas, estando presente em diversos animais (SILVA, 2004).
O Papilomavírus possui DNA fita dupla de genoma circular, variando de 7,3 a 7,9 kb, não envelopado
com capsídeo formado por 72 subunidades (capsômeros ou pentâmeros), com arranjo icosaédrico e podem
acometer os bovinos, sendo diferenciados pelo padrão de papiloma, local atingido e quadros de evolução da
enfermidade (MELO & LEITE, 2003). Em bovinos, atualmente são conhecidos 13 tipos do BPV (SANTOS
et al. 2014). Os vírus são divididos em dois grupos distintos antigenicamente: grupo A que originam
fibropapilomas, e grupo B ocasionando papilomas epiteliais (MELO & LEITE, 2003). Os tipos de
papilomavírus bovino estão incluídos nos gêneros Delta-papillomavirus (BPV-1, 2 e 13), Epsilonpapillomavirus (BPV-5 e 8) e Xi-papillomavirus (BPV-3, 4, 6, 9, 10, 11 e 12) (DE VILLIERS et al. 2004;
SANTOS et al. 2014).
No entanto, esse número limitado nos mostra a necessidade de detectar outros tipos presentes em
infecções, abrindo caminhos para um melhor entendimento sobre a genômica do vírus. Diante disto, o
objetivo do presente estudo foi detectar a prevalência de BPV-1 em amostras de sangue bovino do Estado de
Sergipe.
Material e Métodos
A população de estudo foi composta por 100 amostras de DNA de bovinos originários de sete
rebanhos do estado de Sergipe armazenadas no laboratório GENOMA da UFRPE. O DNA viral foi
amplificado através da técnica de PCR, utilizando a seguinte mistura de reação: 1X Tampão da Taq
polimerase, 2,5 mM MgCl2, 2,5 mM dNTP, 0,5 pmol/µL de cada primer específico (descritos abaixo) e 1U
Taq DNA Polimerase (INVITROGEN). Para a detecção inicial do DNA viral do BPV foram utilizados
primers consenso FAP 59/64 e para a tipagem foi utilizado o par de primers específicos para o BPV-1
(Tabela 1).
Tabela 1. Primers utilizados para detecção e tipagem do Papilomavírus Bovino
Primers
(1)FAP59/FAP64
(2) BPV1F/1R
Sequências
FAP59 5’ – TAA CWG TIG GIC AYC CWT ATT – 3’
FAP64 5’ – CCW ATA TCW VHC ATI TCI CCA TC – 3’
BPV1F 5’ – GGA GCG CCT GCT AAC TAT AGG A – 3’
BPV1R 5’ – ATC TGT TGT TTG GGT GGT GAC – 3’
Tamanho do Fragmento
478 pb
300 pb
As condições da reação de ciclagem foram: Para os primers FAP 59/64: Fase 1: 94 ºC por 10min;
Fase 2: 94 ºC por 1min, 50 ºC por 1 min e 72 ºC por 1min; Fase 3: 72 ºC por 5min. Primers específicos BPV1: Fase 1: 94ºC por 2min; Fase 2: 94 ºC por 40seg, 60 ºC por 40seg e 72 ºC por 40seg; Fase 3: 72 ºC por
2min.
Os produtos das amplificações foram submetidos à separação eletroforética, em gel de agarose a 1%
com tampão TBE, e os resultados foram visualizados sob luz ultravioleta (UV) e posteriormente
fotodocumentados.
Resultados e Discussão
Das 100 amostras de DNA de bovinos analisadas, nenhuma amostra foi positiva para o conjunto de
primers degenerados FAP59 e FAP64. Porém, quando utilizados os primers específicos para o BPV-1 foi
possível a identificação em 68% (68/100) das amostras analisadas.
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Apesar dos conjuntos de primers FAP59/64 serem amplamente usados em estudos epidemiológicos
para detectar o vírus BPV em amostras de lesão epitelial, esses primers mostraram-se pouco eficientes na
detecção do BPV em amostras de tecido sanguíneo, mostrando assim, uma maior sensibilidade do FAP59/64.
(DE VILLERS et al., 2004; MONTEIRO et al., 2008). Porém, não podemos classificar essas amostras como
negativas, pois existe uma relação entre a carga viral, o momento da coleta e a eficiência da técnica como
procedimento de diagnóstico, visto que, se a amostra coletada apresentar-se com baixa carga viral, a PCR
pode vir a não detectar a presença do vírus (MONTEIRO et al., 2008; SANTOS et al. 2014).
Na literatura, embora os BPV sejam descritos como epitélio-específicos, sua presença já foi localizada
em diferentes tecidos e fluidos corporais, sangue periférico, plasma sanguíneo, leite e colostro (FREITAS et
al., 2007; FREITAS et al., 2011). A amplificação do fragmento do gene L1 dos papilomavírus de origem
animal, utilizando-se primers degenerados em PCR convencional, vem se mostrando como uma estratégia
fundamental para a identificação dos tipos de BPV presentes em lesões cutâneas e no sangue periférico.
Além da identificação dos tipos virais já descritos, essas estratégias vêm proporcionando a identificação de
novos tipos virais em diversas espécies animais (CAMPO, 2006; SILVA, 2004; OGAWA et al. 2004).
A detecção de material viral em amostras de sangue total levanta a possibilidade de células sanguíneas
atuarem como sítios de disseminação do vírus para tecidos não-epiteliais e fluidos corporais, em especial o
trato reprodutivo e gametas (BRANDT et al., 2008; FREITAS et al., 2007).
Similarmente ao nosso estudo, outros autores também identificaram subtipos de BPV em amostras de
sangue de bovinos negativos para primers degenerados FAP59 e FAP64, sugerindo a necessidade da
detecção destes em animais supostamente negativos (SANTOS et al., 2014; BRANDT et al., 2008). Estes
dados sugerem que novos estudos sejam realizados para detecção da prevalência desta infecção em animais
sabidamente assintomáticos como uma medida profilática.
Conclusões
Neste estudo, foi possível até o momento, constatar a presença do BPV do tipo 1 em 68% (68/100) das
amostras analisadas.
Literatura citada
BRANDT, S.; HARALAMBUS, R.; SCHOSTER, A.; KINRBAUER, R.; STANEK, C. Peripheral blood
mononuclear cells represent a reservoir of bovine papillomavirus DNA in sarcoid-affected equines. J Gen
Virol, 89: 1390-1395. 2008.
CAMPO, M. S. Bovine papillomavirus: old system, new lessons? In: Campo, M.S. (ed), Papillomavirus
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DE VILLIERS E-M.; FAUQUET C.; BROKER T.R.; BERNARD H.-U. & ZUR HAUSEN, H.
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FREITAS, A. C.; SILVA, M. A. R.; CARVALHO, C. C. R.; BIRGEL, J. E. H.; SANTOS, J. F.; BEÇAK,
W.; STOCCO DOS SANTOS, R. C. Papillomavirus DNA detection in non-epithelial tissues: a discussion
about bovine papillomavirus. In: Mendez-Villas, A. (ed), Communicating Current Research and Educational
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FREITAS, A. C.; SILVA, M. A. R.; JESUS, A. L. S.; MARIZ, F. C.; CORDEIRO, M. N.;
ALBUQUERQUE, B. M. F.; BATISTA, M. V. A. Recent insights into Bovine papillomavirus. Afr. J.
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MELO, C. B.; LEITE, R. C. Papilomatose Bovina. Ciência Veterinária nos Trópicos, v.6, n.1, p.1-12,
2003.
MONTEIRO V.L.C.; SILVA M.A.; CARVALHO C.C.R.; FREITAS A.C.; CUNHA A.L.T.; COELHO
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Pernambuco State. Medicina Veterinária, Recife, v.2, n.2, p.9-15, abr-jun, 2008.
OGAWA T.; TOMITA Y.; OKADA M.; SHINOZAKI H.K.; KAIHO I. & SHIRASAWA H. Broadspectrum detection of papillomaviruses in bovine teat papilomas and health teat skin. J. Gen. Virol, v. 85, p.
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SILVA, L. A. F.; SANTIN, A. P. I.; FIORAVANTI, M. C. S.; JAYNE, V. S.; EURIDES, D.; DIAS FILHO,
F. C.; VERISSIMO, A. C. C.; VIANA FILHO, P. R. L. Avaliação da eficiência de diferentes tratamentos da
papilomatose cutânea bovina. Veterinária Notícias, Uberlândia, v. 10, n. 2, p. 35-41, 2004.
SANTOS, E. U. D.; SILVA, M. A. R.; PONTES, N. E.; COUTINHO, L. C. A. ; PAIVA, S. S. L.; CASTRO,
R. S.; FREITAS, A. C. Detection of Different Bovine Papillomavirus Types and Co-infection in Bloodstream
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