PCR - consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os
elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.
Técnica “inventada” em 1985 por Kary B. Mullis
A técnica já existia, entretanto, a DNA polimerase
utilizada (E. coli) era destruída durante os ciclos de
aquecimento e era necessário adição consecutiva a cada
novo ciclo
Foi o primeiro a sugerir a utilização de uma DNA
Polimerase “termoestável”
1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a
descoberta de uma nova espécie de
bactéria – Thermus aquaticus –
sobrevive na água a temperatura média
de 75ºC
• Polimerização: 5’
3’
Todas as DNA polimerases requerem:
Primer de oligonucleotídeo
http://www.youtube.com/watch?v=QVeVIM1yRMU
Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
Cátion divalente -usualmente Mg2+
DNA molde
PCR requer 7 componentes essenciais:
DNA polimerase termoestável
Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese
de DNA (primers)
Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
Cátion divalente: toda DNA polimerase
Requer cátion divalente, usualmente Mg2+
Tampão para manter o pH
Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl)
DNA molde
A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores (primers).
Oligonucleotídeos com 17 “mers” são usualmente seletivos o suficiente
para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade, tal
como o genoma humano.
O pareamento dos “primers” com a seqüência alvo na template se faz
pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, obedecendo o
pareamento convencional descrito por Watson e Crick:
A T
C G
Desnaturação do DNA molde (template) por aquecimento
Pareamento dos primers à seqüência alvo fita simples
Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável
1. Desnaturação:
• 94ºC – 96ºC
• Separa a dupla fita do template em duas
fitas simples
2. Pareamento:
• 37ºC – 65ºC
• Primers ligam-se em locais específicos do
DNA molde
3. Extensão:
• 72ºC
• DNA polimerase usa os dNTPs
adicionando-os a nova fita de acordo com a
regra de pareamento – polimerização.
Primers:
A concentração ótima de “primer” é
entre 0,1 e 0,5 mM
Ambos os membros do par devem ser
usados na mesma concentração.
Excesso de “primers” induz
aparecimento de produtos
inespecíficos e formação de dímeros de
“primers”.
http://www.youtube.com/watch?v=8-dsnlNsCao