Reação de Polimerização em Cadeia - PCR 1-Introdução 2-Automatização da PCR 3-Sistema de reação 4-Iniciadores – primers A PCR é um sistema para a replicação do DNA in vitro, que permite que uma seqüência “alvo” de DNA seja amplificada em milhares de cópias em apenas algumas horas. Introdução 1985 – Primeira Publicação - Science Cetus Corporation – R. Saiki; F. Faloona; G. Horn; K. Mullis; H. Erlichand; N. Arhneim. Descreveu a PCR: Fragmento específico de DNA multiplicado milhares de vezes – amplificação 1993 – Prêmio Nobel em Química Kary Mullis Ciclos da PCR - Gráfico Etapa 1: DESNATURAÇÃO 94-96˚C por 30’ 1˚ Ciclo Etapa 2: ANELAMENTO 50- 65˚C por 1min 2˚ Ciclo Etapa 3: POLIMERIZAÇÃO 72˚C por 1min Número de ciclos numa reação: 30 a 35 Taq DNA Polimerase Bactéria termoestável Thermus aquaticus Automatização da PCR Ciclos com oscilações entre altas e baixas temperaturas, controladas por computador Termociclador Componentes da PCR Mg 2+ Taq Polimerase Tampão 10x dCTP dNTP dGTP dATP dTTP H20 Milli-Q Iniciadores: Forward/Reverse 4-Iniciadores - primers • Tamanho – entre 10 a 30 bases • Composição de bases - ~50% de G/C • Seqüências – não devem ter complementaridades intra ou inter molecular • Cálculo da Tm 4-Iniciadores - primers Cálculo da Tm - temperatura de anelamento dos iniciadores • Do inglês: melting temperature • Temperatura na qual se tenta obter o equilíbrio entre a formação e a dissociação dos híbridos gerados pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio • Para o cálculo: • Tm= 2(A+T) + 4(G+C) APLICAÇÕES: Medicina forense; identificação de patógenos (diagnóstico molecular); Genótipos (identificação de vírus, p. ex.)