UPC II – Microbiologia
Aula prática 9
2012/2013
Maria José Correia
26/11/2012
Sumário P9:

Identificação de Streptococcus por PCR

Pesquisa de um gene como marcador filogenético


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Preparação da suspensão celular bacteriana através de lise
por fervura
Amplificação do fragmento de DNA por PCR
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Identificação de bactérias
o Métodos clássicos fenotípicos: bioquímicos, imunológicos
avaliação de resistência (morosos).
o Métodos moleculares genotípicos: métodos baseados em PCR e
variantes: RAPD-PCR, rep-PCR, ARDRA, multiplex PCR.
•
Filogenia
• análise da sequência 16S rRNA
• Genes “housekeeping”
-universais
-conservação estrutural e funcional
•
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Marcadores genéticos (específicos de um microrganismo)
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Streptococcus mutans
• Patogénico maioritário associado a cáries dentárias (crianças)
•Processo rápido, específico e sensível para diagnóstico:
•PCR – primers específicos para identificação
(Sequência alvo: região intergénica localizada entre o fim e
o início do cromossomal circular)
Sm479F: 5 -TCGCGAAAAAGATAAACAAACA-3
Sm479R: 5 -GCCCCTTCACAGTTGGTTAG-3
permitem identificar a presença de S. mutants
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PCR

Desnaturação da cadeia dupla de DNA
Hibridação com primers específicos (iniciadores
da reacção)


Extensão do fragmento
DNA polimerase
 dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf
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Reacção de PCR
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Reação de PCR
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Trabalho a realizar
o Preparação de suspensão celular (lisado), que
serve como DNA molde da reacção de PCR.
o Pipetar 10l de meio de cultura para um
microtubo.
o Centrifugar 10minutos à Vmáx.
o Pipetar o meio e substituir por água esteril.
o Ferver 10minutos,
o Centrifugar 10minutos à Vmáx.
o Preparar a reação de PCR em gelo
o Iniciar amplificação no termociclador.
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Trabalho a realizar
o Preparar reação de PCR
o Isolado e amostra de DNA (controlo)
• Primers para S. mutans
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Preparação da reacção de PCR
dH20 estéril
10
Tampão NH4+ (10x)
2,5
MgCl2 (25mM)
2,5
dNTP's (2mM)
3
F-Primer (10M)
1
R-Primer (10M)
1
Taq (1U/ul)
1
DNA
4
Vtotal
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25l
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Programa de amplificação
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temperatura
minutos
Desnaturação inicial
95ºC
10:00
Desnaturação
95ºC
00:30
“Annealing”
62ºC
00:30
Extensão
72ºC
01:00
Extensão final
72ºC
10:00
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40 ciclos
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