Instruções de utilização
Família Dynal SSP
+
AllSet ™ e
+
CombiSet ™
0088
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
CONTEÚDO
Página
INDICAÇÕES DE UTILIZAÇÃO…………………………………………………...……..…… 3
RESUMO E EXPLICAÇÃO…….........………………...…………………………............…… 3
PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO …………………………………...............……..…….. 3
REAGENTES..........................................................…................………………………..… 4
Fornecidos no Kit de tipagem………………………………………………. ….…...... 4
Conservação.....………………………………………………………………....…….... 4
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES ………………………………………………………… 5
EQUIPAMENTO NECESSÁRIO MAS NÃO FOI FORNECIDO PELA DYNAL .....……… 5
PROCEDIMENTO........……………………………….....………….........…………………….
Colheita e preparação de amostras..........................……………….............….
Preparação da amplificação por PCR..............................………...............…..
Amplificação por PCR .................................…………..……………..........….…
Detecção da PCR utilizando a electroforese em gel de agarose.....………….
6
6
6
8
9
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO ...............................................……........….....……. 10
VALORES ESPERADOS….…….....………………………………………….……………….. 10
Controlo de Qualidade………….............................……………….............….. 10
Controlo dos testes internos……………………………………………………….. 10
Interpretação dos resultados......... ..............…....................………....…...… 11
Interpretação utilizando a Dynal SSPTool™ ………………..……………….
11
GUIA PARA RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS .............………..................…....……..
12
BIBLIOGRAFIA ..................…………………….…........…………...….......…..........…...... 13
GARANTIA …………………………………………………………………………….………. 14
MARCAS COMERCIAIS UTILIZADAS NESTE DOCUMENTO/PRODUTO……..…..… 14
PATENTES UTILIZADAS NESTE DOCUMENTO/PRODUTO .........……...…………..... 14
INFORMAÇÃO DE CONTACTOS................................................................................... 15
Página 2 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
Para uso em Diagnóstico In Vitro
UTILIZAÇÃO INDICADA___
Tipagem a partir do DNA dos Alelos HLA de Classe I ou Classe II.
RESOLUÇÃO DA TIPAGEM
Kits de Baixa Resolução: Os alelos serão resolvidos a nível genérico ou a nível dos grupos alélicos, os
quais geralmente estão em concordância com as especificações definidas serologicamente.
Kits de Alta Resolução: Ou kits de subtipagem, asseguram a genotipagem de alta resolução ou a nível de
alelos.
RESUMO E EXPLICAÇÃO
Quase todas as técnicas de tipagem de tecidos a partir do DNA utilizam a técnica da reacção de
polimerização em cadeia (PCR – polymerase chain reaction)1 para amplificar o locus HLA a ser
investigado. Na maior parte dos métodos de tipagem de tecidos a partir do DNA, utiliza-se a técnica de
PCR como passo de amplificação pré-tipagem para aumentar a quantidade do DNA alvo. Portanto, o
processo de tipagem HLA requer um passo pós-amplificação para descriminar entre os diferentes
alelos. Ao contrário de outros métodos baseados na PCR, a Metodologia de SSP 2,3,4,5 utilizada pela
Dynal Biotech Ltd – SSP AllSet+™ e CombiSet+™, discrimina entre os diferentes alelos durante o
processo da PCR. Deste modo diminui-se o tempo de processamento de pós-amplificação para um
simples passo de detecção por electroforese em gel.
PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
O método de Dynal SSP é uma técnica baseada na PCR, que utiliza uma Sequência de Iniciadores
Específicos (Sequence Specific Primers – SSP) para tipagem tecidular a partir do DNA.
Os produtos de Dynal SSP consistem em painéis de misturas de iniciadores nos quais cada mistura de
iniciadores contém um ou mais pares de iniciadores específicos, isto é, os iniciadores específicos de
alelos e/ou de grupos de alelos, assim como um par de iniciadores de controlo que corresponde às
sequências não alélicas das amostras. O par de iniciadores de controlo funciona como um controlo
interno da PCR para verificar a eficiência das amplificações por PCR.
Os Dynal SSP baseiam-se no princípio de que um iniciador que corresponda com perfeição será
utilizado com mais eficiência na reacção de PCR do que um iniciador que possua uma ou várias
correspondências deficientes na sua cadeia de extremidade 3’. A especificidade do sistema de tipagem
é uma parte integrante do passo de amplificação por PCR e o processamento pós-amplificação das
amostras é reduzido a um mínimo.
A atribuição de alelos consiste simplesmente em determinar se a amplificação ocorreu ou não, ou seja a
visualização e detecção da amplificação por electroforese em gel de agarose. A técnica de PCR-SSP
proporciona um alto grau de resolução porque cada par de iniciadores identifica dois locais polimórficos,
de localização cis, ligados. O método assegura sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade
elevadas.
Página 3 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
REAGENTES
Reagentes fornecidos em todos os Kits Dynal SSP AllSet+™ou CombiSet+™
Item
Descrição
1. Tabuleiros de PCR com misturas
de iniciadores SSP secas e repartidas
em alíquotas
Cada poço do tabuleiro de PCR contém uma solução seca
de iniciadores SSP constituída pelos iniciadores
específicos de alelos e/ou de grupos de alelos, assim
como por um par de iniciadores de controlo que
corresponde às sequências não alélicas. O par de
iniciadores de controlo amplifica um fragmento de um
gene conservado que está presente em todas as
amostras.
2. Tampas de PCR
Tampas para fechar os Tabuleiros de PCR
N.º de
reacções de
PCR por teste
3. Mistura Principal (o n.º de ampolas
incluído depende do n.º de reacções
de PCR por teste – ver o quadro
oposto)
N.º de ampolas de
Mistura Principal
incluídas no kit
(todas com 1,8 ml)
1-9
1
10-20
2
21-40
3
41-95
4
96
5
Pronto a usar com 1 x concentração. A Mistura Principal
foi optimizada para ser utilizada com AmpliTaq® DNA
Polymerase (Roche Molecular Systems, Inc.)
Informações sobre a formulação disponíveis em
[email protected]
4. Folheto de Instruções de Utilização
do produto / Folheto de Informação
sobre o Lote Específico do Produto
Folheto de Instruções de Utilização do produto / Folheto
de Informação sobre o Lote Específico do Produto.
5. Folha de cálculo para interpretação
Uma folha de cálculo para determinar qual é o
alelo ou grupo de alelos com que se identificam
as respectivas misturas de iniciadores.
Conservação
1. Os tabuleiros de PCR e a Mistura Principal devem ser conservados a 2-8˚C.
2. Não congelar os reagentes
3. Se conservados nas condições correctas, estes reagentes e as misturas de iniciadores são estáveis
até expirar o prazo de validade indicado no folheto de Informação sobre o Lote Específico do Produto.
Página 4 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
AVISOS E PRECAUÇÕES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Para Uso em Diagnóstico In Vitro
Todo o trabalho efectuado com Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™ deve ser realizado seguindo
as Boas Práticas de Laboratório e de acordo com as directrizes locais, p. ex., normas da EFI e
directrizes da CPA.
Aviso de biorisco: Manusear todas as amostras como se fossem capazes de transmitir doença.
Todo o trabalho deve ser efectuado usando luvas e protecção apropriada.
Aviso de biorisco: Devem utilizar-se tubos com tampas de rosca para a preparação dos
espécimes a fim de prevenir salpicos do espécime e contaminação potencial.
Aviso de biorisco: Todos os espécimes devem ser manuseados como infecciosos utilizando
procedimentos laboratoriais seguros como os descritos em Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories6 e no Documento M29-T do NCCLS 7. Limpar e desinfectar muito bem
todas as superfícies de trabalho com lixívia a 1% (NaClO). Autoclavar todo o equipamento ou
materiais que entraram em contacto com espécimes clínicos, antes da eliminação.
Aviso de biorisco: O brometo de etídio utilizado para coloração do DNA é um agente
carcinogénico potencial. Usar sempre luvas de nitrilo durante o manuseamento de geles corados
e de brometo de etídio.
Atenção: Usar protecção ocular com bloqueio do UV e não olhar directamente para uma fonte
luminosa UV com os olhos não protegidos durante a observação ou a fotografia de geles.
Atenção: As pipetas utilizadas para manipulações pós-PCR não devem ser utilizadas para
manipulações pré-PCR.
Atenção: Contaminação. Evitar a contaminação microbiana dos reagentes durante a
extracção de alíquotas dos frascos de reagentes. Usar sempre luvas para evitar qualquer risco
de contaminação das amostras. Recomenda-se a utilização de pipetas e de pontas de pipetas
com filtros descartáveis. Não utilizar reagentes que se apresentem turvos ou com sinais de
contaminação microbiana.
Atenção: Eliminação: Eliminar todos os reagentes não utilizados e os resíduos de acordo com
as normas locais, estatais, federais e nacionais.
Folha de Dados de Segurança dos Materiais (MSDS) está disponível para descarregar em
www.tissue-typing.com ou a pedido junto do escritório local da Dynal Biotech. (Ver as
informações sobre contactos na última página deste folheto)
EQUIPAMENTO NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO PELA DYNAL BIOTECH:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Dispositivos de pipetagem manual (p. ex., Eppendorf, Gilson)
Pontas de pipetas com filtros descartáveis para os dispositivos acima mencionados
Misturador Vórtex
Micro-centrífuga
Suporte de micro-tubos para os tabuleiros de PCR
Sistema de PCR Perkin-Elmer GeneAmp® 9600 ou 9700 ou qualquer termociclador
autorizado com uma especificação equivalente
Placa aquecida / micro-ondas para aquecimento das soluções de agarose
Aparelho de electroforese (p. ex., ABgene Electro-Fast® Stretch 108 Complete, AB-0708)
Transiluminador com luz UV
Sistema de documentação fotográfica/de imagem em gel
Taq Polimerase Recombinante (Dynal recomenda a AmpliTaq®)
Agarose de grau electroforético
Brometo de etídio
Página 5 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
PROCEDIMENTO
NOTA: Este procedimento deve ser efectuado em duas áreas separadas do laboratório (Amplificação préPCR e Amplificação pós-PCR) tal como indicado nas instruções seguintes.
COLHEITA E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS
Cuidado: Manusear todos os espécimes como se fossem capazes de transmitir agentes
infecciosos.
a)
NÃO SE RECOMENDA A UTILIZAÇÃO DE SANGUE HEPARINIZADO8.
b)
O DNA pode ser extraído de qualquer tipo de células humanas nucleadas utilizando
o método preferido.
c)
Para obtenção de resultados óptimos de amplificação e tipagem com PCR-SSP,
utilizar DNA de alta pureza (OD 260:280 razão 1,6-1,8).
d)
A concentração final do DNA antes da PCR-SSP deve ser aproximadamente de
50 ng/µl.
e)
O DNA extraído deve ser diluído em dH20.
f)
O DNA pode ser conservado a -20˚C ou a temperaturas inferiores durante períodos
prolongados (> 1 ano) sem efeitos adversos nos resultados. O DNA conservado a
+4˚ durante períodos prolongados sofrerá uma degradação, dando origem a mais
artefactos, por exemplo amplificações não específicas.
PREPARAÇÃO DA AMPLIFICAÇÃO POR PCR (Efectuada na área pré-PCR)
Para efectuar uma tipagem simples fazer a seguinte mistura de PCR. Consultar a tabela da página
seguinte para obtenção dos volumes necessários (em função do n.º de reacções de PCR por teste)
•
•
•
Mistura Principal
DNA da amostra (a 50 ng/µl)
DNA polimerase AmpliTaq®(a 5 i.u./µl )
•
•
Misturar bem.
Distribuir 10 µl da mistura acima de PCR em cada poço do tabuleiro Dynal SSP AllSet+™ ou
CombiSet+™.
Colocar as tampas de PCR e fechar bem para garantir que os tubos ficam bem vedados. Pode
utilizar-se uma ferramenta de fecho. Também se podem utilizar lâminas adesivas de vedação
compatíveis com PCR. Neste momento as amostras estão prontas para a amplificação por PCR
Conservar os reagentes restantes do kit a 2-8˚C.
•
•
Página 6 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
Tabela de cálculo para Misturas de PCR:
Reacções Solução
da MP
de PCR
(µl )
por teste
DNA da
amostra
(µl )
AmpliTaq®
(µl )
1
4
6
8
10
32
48
64
80
96
7,6
11,4
15,2
19,0
22,8
0,32
0,48
0,64
0,80
0,96
12
14
16
18
20
112
128
144
160
176
26,6
30,4
34,2
38,0
41,8
1,12
1,28
1,44
1,60
1,76
22
24
26
28
30
208
224
240
256
272
49,4
53,2
57,0
60,8
64,6
2,08
2,24
2,40
2,56
2,72
40
42
44
46
48
352
384
400
416
432
83,6
91,2
95,0
98,8
102,6
3,52
3,84
4,00
4,16
4,32
96
864
206,0
9,00
NOTA: Para números ímpares de reacções de PCR não indicados na tabela acima, basear-se no
número par mais elevado seguinte (p.ex., no caso de 13 reacções de PCR por teste, consultar os
cálculos relativos a 14 reacções de PCR).
Página 7 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
DISPOSIÇÃO NO TABULEIRO
A orientação do tabuleiro é assegurada pela mistura de iniciadores no poço número um (também
identificado pelo uso de um corante azul), que é marcado com o número do lote impresso na face
lateral.
e.g HLA-X
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
QUALQUER OUTRO NÚMERO MOLDADO NO TABULEIRO DE PLÁSTICO, P. EX. 1,2,3 DEVE SER
IGNORADO
PREPARAÇÃO DA AMPLIFICAÇÃO POR PCR (Efectuada na área pós-PCR)
1.
Colocar o tabuleiro de SSP AllSet+™ ou CombiSet+™ no termociclador
Programar o termociclador utilizando os parâmetros seguintes:
Passos
Um passo de
desnaturação
10 ciclos
20 ciclos
Temperatura
(˚C)
96
Tempo(s)
Acção
120
Desnaturação
96
65
15
60
96
61
72
10
50
30
Desnaturação
Hibridação
Elongação
Desnaturação
Hibridação
Elongação
Para informações específicas do termociclador, consultar o manual do fabricante.
2.
3.
Iniciar o programa
Quando o programa estiver terminado, retirar as amostras do termociclador
NOTA: Não levar DNA amplificado para a área de amplificação pré-PCR
Página 8 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
DETECÇÃO DA PCR UTILIZANDO ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE
Nota: Recomenda-se que seja utilizado o mesmo tampão para fazer o gel e como tampão de
migração, isto é, caso se utilize 0,5 x TBE no gel, utilizar também 0,5 TBE como tampão de
migração.
1.
Preparar um gel de agarose a 2% (p/v) (ABgene MultiABgarose, AG-0100c) em tampão 0,5 x
TBE
a)
Dissolver a agarose (2 g/100 ml de tampão 0,5 x TBE) fervendo num forno de microondas até à dissolução completa.
• Arrefecer a 60˚C.
• Adicionar o brometo de etídio até perfazer uma concentração final de 0,5 µg/ml
de gel.
b)
Moldar o gel com uma espessura de 3-4 mm com poços com 3 mm de largura.
• Deixar solidificar durante pelo menos 15 minutos.
2.
a)
Transferir o gel de agarose para uma unidade submersa de electroforese em gel.
Cobrir o gel com 0,5 x TBE até uma profundidade de 1-2 mm.
• Retirar cuidadosamente o pente.
• Carregar todo o produto da PCR em sequência directa e cuidadosamente no
gel.
3.
Fazer migrar os geles em tampão 0,5 x TBE.
Migrar os minigeles (um gel a menos de 10 cm entre eléctrodos) durante 10 minutos a
15 V/cm e os geles maiores durante 15 minutos a 10 V/cm.
Para calcular a tensão, medir a distância (em centímetros) entre os ELÉCTRODOS na tina
de electroforese; o comprimento do gel NÃO É IMPORTANTE).
4.
Examinar o gel sob iluminação UV e documentar com fotografia.
1.
O mesmo tampão 0,5 x TBE pode ser utilizado várias vezes, mas o desempenho
pode ser melhorado utilizando um tampão recente.
ADVERTÊNCIA: O brometo de etídio é um potente agente mutagénico. Usar luvas de nitrilo
e protecção ocular sempre que manusear geles ou soluções contendo
brometo de etídio.
Página 9 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
1. Devido à sensibilidade analítica elevada da PCR, deve ter-se extremo cuidado para conservar a
pureza dos reagentes do kit ou das misturas de amplificação. Assegurar que o curso do trabalho no
laboratório prossegue de maneira unidireccional e que o amplicon da PCR não é levado para a área
de preparação da PCR. A pureza dos reagentes só é mantida seguindo as boas práticas de
laboratório e o desempenho do teste só pode ser garantido pela adesão rigorosa aos
procedimentos especificados no folheto incluído nesta embalagem.
2. Os testes Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ foram desenvolvidos utilizando apenas espécimes de
sangue inteiro não heparinizado e espécimes de DNA purificado. Não se avaliou o desempenho
com outros espécimes.
3. A amostra de DNA fornece o molde para o processo de amplificação por PCR e a sua qualidade
tanto no que respeita à pureza como à concentração deve estar dentro dos limites especificados
neste procedimento.
4. Com este produto pode ser utilizado qualquer termociclador autorizado, desde que as
especificações do instrumento sejam equivalentes às dos Sistemas Perkin-Elmer GeneAmp® PCR
9600 ou 9700.
5. Assegurar que todos os instrumentos e equipamento são calibrados de acordo com as
recomendações do fabricante.
VALORES ESPERADOS
Controlo de qualidade
O controlo de qualidade e a actualização dos produtos de tipagem de tecidos a partir do DNA é muito
importante. Os oligonucleótidos sintetizados devem ser extensivamente testados em relação a DNAs de
linhas celulares conhecidas. As soluções de iniciadores necessitam de ser testadas em relação a DNAs
positivos e a DNAs negativos com uma sequência de alta similaridade.
O procedimento de controlo de qualidade consiste no seguinte:
• Teste da síntese de iniciadores em relação a um painel de DNAs de linhas celulares bem
caracterizadas.
• Teste de soluções de um iniciador específico em relação a um painel de DNAs negativos e
positivos.
• Teste de um conjunto completo de SSP.
• Teste do produto final.
Controlo positivo interno da PCR
O par de iniciadores de controlo9 encontra-se incluído para verificar a eficiência da reacção de PCR.
A sua presença confirma que a ausência de uma amplificação específica em qualquer reacção dada é
efectivamente devida à ausência de polimorfismo na amostra de DNA e não resultante de uma falha da
amplificação por PCR.
Devido às diferentes concentrações e temperaturas de hibridação dos pares de iniciadores específicos
em comparação com o par de iniciadores de controlo interno:
- A intensidade da banda de controlo diminui muitas vezes na presença de uma amplificação
específica e
- os iniciadores de controlo interno são mais sensíveis a condições não óptimas da PCR e
podem ser utilizados para monitorizar a eficiência da PCR.
A amplificação sem sucesso dos fragmentos de controlo interno em sequências sem amplificações
específicas deve ser considerada como sinal de um sistema não óptimo. Consultar a secção sobre
resolução de problemas para as causas possíveis e as acções correctas.
O folheto de informações Específicas sobre cada lote de produto, incluído com cada kit, inclui
informações específicas relacionadas com o controlo positive interno.
Página 10 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Os alelos são atribuídos através da presença de um produto específico da PCR. Uma amplificação
específica numa sequência indica que a amostra de DNA contém o alelo ou um alelo no grupo de alelos,
definido pelo par de iniciadores naquela reacção de PCR. A tabela de interpretação fornecida com cada
lote pode ser utilizada para atribuir o alelo ou grupo de alelos identificado pelas respectivas soluções de
iniciadores.
Não em todos, mas em muitos dos Kits de Dynal SSP AllSet+™ ou CombiSet+™, cada alelo ou grupo de
alelos é amplificado por mais do que uma solução de iniciadores. É importante verificar se todas as
outras soluções de iniciadores, que devem ser positivas por conterem aquele alelo ou grupo de alelos,
são de facto positivas.
Embora os alelos sejam atribuídos pela presença do produto da PCR, os tamanhos relativos dos produtos
da PCR podem ser úteis na interpretação das tipagens por SSP.
Os tamanhos aproximados dos produtos específicos da PCR podem ser utilizados para distinguir entre
uma amplificação realmente positiva e:
- artefactos resultantes de oligómeros iniciadores (dímeros iniciadores)
- contaminação a partir de poços adjacentes
- amplificações não específicas
Na tabela de interpretação fornecida com cada Kits de Dynal SSP AllSet+™ ou CombiSet+™ é dada a
sequência para os três nucleótidos mais terminais que determinam a especificidade da extremidade 3’
dos iniciadores directo e reverso.
•
•
Para os produtos HLA de Classe I, é dada a posição do nucleótido no 2.º, 3.º ou 4.º exão que
corresponde à extremidade 3’ dos iniciadores.
Nos casos dos Kits de SSP AllSet+™ HLA de Classe II, é dada a posição do codão
correspondente à extremidade 3’ dos iniciadores.
Se existir a sequência de um novo alelo não incluído na tabela de interpretação, a informação da
sequência do iniciador pode ser utilizada para determinar o padrão de amplificação do novo alelo. Neste
caso, contactar o departamento de Serviços Técnicos pelo correio electrónico: [email protected]
ou envie um fax para: +44 151 346 1223.
Interpretação utilizando Dynal SSPTool™
Dynal SSPTool™ é um software especialmente concebido para auxiliar na interpretação dos resultados.
A tabela de interpretação específica de cada lote individual dos kits de SSP AllSet+™ e CombiSet+™ é
introduzida na base de dados do software. A base de dados é actualizada continuamente sempre que
são lançados novos lotes de produtos.
Para ajuda e informação sobre a introdução de resultados e utilização do software, consultar a secção
de Ajuda de SSPTool™.
Para encomenda de uma cópia gratuita de Dynal SSPTool™ (código do produto 990.80), contactar o
representante local da Dynal Biotech.
Página 11 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
GUIA PARA RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS
PROBLEMA
Ausência de amplificação
(não houve amplificação
dos fragmentos de
controlo interno nem
amplificação específica)
“
CAUSA
DNA em muito pouca quantidade
O DNA contém inibidores da PCR, p.ex., proteínas, etanol (dos
passos de precipitação).
“
O DNA foi extraído de sangue heparinizado
“
O DNA é dissolvido num tampão contendo EDTA
Falha aleatória da
amplificação
As tampas dos tubos de PCR que não foram bem fechadas dão
origem a evaporação e subsequente falha da amplificação
“
Erros na carga do gel
“
“
“
Fragmentos do controlo
interno fracos
“
“
“
“
Amplificação não
específica (em escada ou
com manchas)
Sinais de amplificação
mais fracos com o decorrer
do tempo
“
Uso de pipetas não calibradas
“
“
Padrões de amplificação
estranhos
“
“
Bandas indistintas,
esbatidas
“
Amplicon não carrega
correctamente
Verificar se o volume e a concentração de DNA adicionado estavam
correctos
Determinar a qualidade do DNA. Siga exactamente o método de
extracção do DNA dos fornecedores.
Tentar um método de extracção do DNA alternativo
Tornar a extrair o DNA
Utilizar sangue não heparinizado ou tentar um tratamento com
heparinase (Ver Ref 8)
Repetir a extracção do DNA e dissolver o DNA em água estéril
Verificar que todas as tampas estão bem fechadas
Usar a ferramenta de fecho
Verificar se foi carregado o número correcto de poços e se cada
poço contém aproximadamente o mesmo volume de mistura de
PCR
Calibrar por rotina todas as pipetas de acordo com as
recomendações dos fornecedores
Erros de pipetagem
Efectuar a pipetagem com mais cuidado
O DNA da amostra, a Taq polimerase ou as pré-misturas da PCR
não foram bem misturadas antes da utilização
Misturar rapidamente no Vórtex antes da utilização
DNA impuro
Determinar a qualidade do DNA. Repetir a extracção do DNA com
soluções recentemente preparadas.
Pouca quantidade de DNA
Determinar a concentração do DNA e ajustá-la para 50 ng/µl
Temperatura de hibridação demasiado alta. O termociclador não
está calibrado
Calibrar o termociclador e verificar o programa da PCR. Um
termociclador utilizador para PCR-SSP de rotina deve ser calibrado
de 6 em 6 meses.
A quantidade de DNA polimerase termoestável é pouca.
Utilizar mais enzima nas reacções de PCR
A DNA polimerase termoestável é de má qualidade.
Utilizar Amplitaq® da Perkin-Elmer
DNA impuro
(Algumas misturas de iniciadores têm uma tendência mais elevada
de originar uma amplificação não específica, ver as notas de rodapé
em cada tabela de especificidade específica)
Todos os fragmentos maiores do que o fragmento do controlo
interno podem ser desprezados
Verificar a qualidade do DNA
Repetir a extracção do DNA
A ausência de DNA também pode causar manchas
A solução de coloração de brometo de etídio do gel de agarose é
antiga
Preparar uma nova solução de brometo de etídio para obter uma
melhor coloração do gel.
Uma das lâmpadas de UV está partida
Verificar o equipamento de iluminação UV.
Calibrar o termociclador e verifique o programa da PCR. Um
termociclador utilizador para PCR-SSP de rotina deve ser calibrado
de 6 em 6 meses.
Usar luvas e pontas de pipeta contendo tampões de filtração. Utilizar
áreas separadas para a pré e pós-PCR. Manusear correctamente
as amostras em todos os passos. Verificar quanto a sinais de
contaminação utilizando iniciadores de controlo da contaminação da
Dynal (código do produto 990.05)
Determinar a qualidade do DNA. Repetir a extracção do DNA com
soluções recentemente preparadas.
Calibrar o termociclador e verificar o programa da PCR. Um
termociclador utilizador para PCR-SSP de rotina deve ser calibrado
de 6 em 6 meses.
Verificar se o número de lote do produto utilizado é o mesmo da
tabela de interpretação utilizada.
Verificar se todas as amplificações específicas são correctas ou se
um artefacto (contaminação, dímero iniciador) pode ter sido mal
interpretado como uma amplificação.
Repetir a tipagem. Se o novo padrão de amplificação for
reprodutível, contactar o representante local da Dynal Biotech para
informações respeitantes ao padrão de amplificação dos alelos
recentemente descritos.
Utilizar o tampão TBE recomendado.
Efectuar a migração numa tensão inferior
Utilizar pentes finos (4x1 mm)
Utilizar o mesmo tampão como tampão do gel e de migração
0,5 x TBE é recomendado
Pipetar correctamente
Temperatura de hibridação demasiado alta, o termociclador não está
calibrado
Amplificações positivas
falsas
ACÇÃO
Pode ser causado por Contaminação
DNA impuro
Temperatura de hibridação demasiado alta.
O termociclador não está calibrado.
É utilizada a tabela de interpretação incorrecta
O padrão de amplificação contém um ‘falso positivo’
Novo alelo, não incluído na tabela de interpretação
O tampão de electroforese pode estar quente
O pente utilizado tem fendas muito espessas
Tampão de migração com concentração diferente do tampão do gel utilizado
Tampão de migração incompatível com o amplicon da PCR
Bolhas de ar na pipeta
Página 12 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
BIBLIOGRAFIA
1)
Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N.
Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for
diagnosis of sickle cell anemia.
Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4.
2)
Wu, D. Y., Ugozzoli, L., Pal, B. K. & Wallace, R. B. (1989). Allele-specific enzymatic amplification of
beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia. Proc Natl Acad Sci U S A 86(8),
2757-60.
3)
Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J.
C. & Markham, A. F. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory
mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res 17(7), 2503-16.
4)
Olerup, O. & Zetterquist, H. (1992). HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific
iniciadores (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice
including donor-recipient matching in cadaveric transplantation [see comments]. Tissue Antigens
39(5), 225-35.
5)
Bunce, M., O'Neill, C. M., Barnardo, M. C. N. M., Krausa, P., Browning, M. J., Morris, P. J. &
Welsh, K. I. (1995b). Phototyping: Comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3,
DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 iniciador mixes utilising sequence-specific iniciadores
(PCR-SSP). Tissue Antigens 46(5), 355-367.
6)
Richmond, Y. and McKinney, W. (eds.) 1993. Biosafety in microbiological and biomedical
laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
7)
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of Laboratory Workers from
Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue. Tentative Guideline. NCCLS
Document M29-T Villanova, PA:NCCLS, 1989.
8)
Satsangi J, Jewell DP, Welsh K, Bunce M, Bell JI.Effect of heparin on polymerase chain reaction.
Lancet. 1994 Jun 11;343(8911):1509-10.
9)
Bein G, Glaser R, Kirchner H. Rapid HLA-DRB1 genotyping by nested PCR amplification. Tissue
Antigens. 1992 Feb;39(2):68-73
Página 13 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
GARANTIA
Os produtos são garantidos ao primeiro comprador apenas como estando em conformidade com a
quantidade e conteúdo declarados nas ampolas e nos rótulos exteriores durante o prazo de validade
declarado. A obrigação da Dynal Biotech e o recurso exclusivo do comprador ao abrigo desta garantia estão
limitados a substituição, à custa da Dynal Biotech, de quaisquer produtos que possam ter defeitos de fabrico
e que deverão ser devolvidos à Dynal Biotech, com transporte pré-pago, ou segundo o critério da Dynal
Biotech, ao reembolso do preço de compra.
Reclamações relativas a mercadoria danificada em trânsito devem ser apresentadas à empresa de transporte.
Esta garantia não se aplicará a produtos que possam ter sido alterados fora da Dynal Biotech, nem se aplicará
a produtos que foram sujeitos a má utilização ou manipulação incorrecta. TODAS AS OUTRAS GARANTIAS,
EXPRESSAS, IMPLÍCITAS OU ESTATUTÁRIAS, SÃO PELA PRESENTE ESPECIFICAMENTE EXCLUÍDAS,
INCLUINDO, MAS NÃO LIMITADAS A, QUALQUER GARANTIA DE COMERCIALIZAÇÃO OU ADEQUAÇÃO
A UM DETERMINADO FIM. A responsabilidade máxima da Dynal Biotech está limitada em todas as
circunstâncias ao preço dos produtos vendidos pela Dynal Biotech. EM CIRCUNSTÂNCIA ALGUMA A DYNAL
BIOTECH SERÁ RESPONSÁVEL POR QUAISQUER DANOS ESPECIAIS, ACIDENTAIS OU INDIRECTOS.
Alguns estados não permitem limites em garantias ou em recursos por violação em determinadas transacções.
Em alguns estados, podem não se aplicar os limites acima descritos.
Este produto não pode ser reembalado, reformulado ou novamente vendido sem o consentimento por escrito
da Dynal Biotech Ltd., U.K.
MARCAS COMERCIAIS UTILIZADAS NESTE DOCUMENTO/PRODUTO
Dynal® é uma marca registada da DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Noruega
AllSet™ e AllSet+™ são marcas comerciais da DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Noruega
DynaMix™ é uma marca comercial da DYNAL BIOTECH Ltd., R.U.
CombiSet™ e CombiSet+™ são marcas comerciais da DYNAL BIOTECH., R.U.
SSPTool™ é uma marca comercial da DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Noruega
AmpliTaq® é uma marca registada da Roche Molecular Systems, Inc. E.U.A.
Electro-Fast® é uma marca registada da Advanced Biotechnologies Ltd (ABgene®)
GeneAmp® é uma marca comercial da Roche Molecular Systems, Inc. E.U.A.
PATENTES UTILIZADAS NESTE DOCUMENTO/PRODUTO
* Os produtos Dynal SSP são vendidos sob licença de ARMS™ da ZENECA Ltd. com respeito à Patente
Europeia N.º 0332435 e propriedade internacional de patentes correspondente. ARMS™ é uma marca comercial
da ZENECA Ltd.
** Este produto foi optimizado para utilização no Processo da Reacção de Polimerização em Cadeia (“PCR”)
que é coberto por patentes pertencentes à Roche Molecular Systems Inc. e à F. Hoffmann-La Roche Ltd.
(“Roche”). Nenhuma licença, ao abrigo destas patentes, para utilização do Processo da PCR é transferido
expressamente ou por inferência para o comprador aquando da aquisição deste produto. Outras informações
sobre licenças de aquisição para utilizar o Processo da PCR podem ser obtidas contactando, nos Estados
Unidos, o Director de Concessão de Licenças na Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue,
Alameda, Califórnia, 94501, e fora dos Estados Unidos, o Director de Concessão de Licenças da PCR, F.
Hoffman-La Roche Ltd, Grenzacherstr. 124, DH-4070 Basileia, Suíça.
Fabricado pela Dynal Biotech Ltd., R.U.
Desenvolvido pela Dynal Biotech Ltd., R.U.
Página 14 de 15
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Kits de Dynal SSP AllSet+™ e CombiSet+™
Informações sobre contactos
Dynal Biotech Ltd.,
11 Bassendale Road, Croft Business Park,
Bromborough, Wirral, CH62 3QL, U.K.
Tel: +44 151 346 1234, Fax: +44 151 346 1223
E-mail: [email protected], Internet: http://www.tissue-typing.com
Dynal Biotech A.S.A
PO Box 114 Smestad,
N-0309, Oslo, Noruega
Tel: +47 2206 1000
Fax: +47 22 50 70 15
E-mail:[email protected]
Internet: http://www.dynalbiotech.com
DYNAL BIOTECH GmbH
Bramfelder Chaussee 41
22177 Hamburg, Alemanha
Tel: +49 40 36 15 73-0
Fax: +49 40 36 15 73-30
E-mail: [email protected]
Dynal Biotech Inc.
HLA Diagnostics Division
555 Andorra Glen Court
Suite 5 Lafayette Hill, PA 19444, EUA
Toll Free: +1 1866 DYNAL TT (396 2588)
Tel: +1 610 940 1511
Fax: +1 610 940 3606
E-mail: [email protected]
Dynal Biotech S.A.
Centre de Transfert de I’U.T.C.,
66 Avenue de Landshut
60200 Compiègne, França
Tel: +33 3 44 23 45 95
Fax: +33 3 44 23 16 14
E-mail: [email protected]
Dynal Biotech Pty
PO Box 204, Carlton South,
Victoria 3053, Austrália
Tel: 1 800 623 453
Tel: +61 3 9663 5777
Fax: +61 3 9663 6660
NZ Freecall: 0800 448 246
E-mail: [email protected]
Para informações sobre os distribuidores da Dynal a nível mundial queira contactar a Dynal Biotech Ltd
© Copyright 2003 Dynal Biotech Ltd., U.K. Reservados todos os direitos
Impresso a 12.03. Rev. 000
Página 15 de 15