Genética Molecular
em Análises Clinicas
TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE
ÁCIDOS NUCLEICOS
Técnicas de amplificação de ácidos
nucleicos
– PCR
– Real Time PCR
– NASBA/TMA
PCR
OPTIMIZAÇÃO DO PCR
•
•
•
•
•
•
[MgCl2]
Th
[dNTP]
[primers]
[DNA]
[inibidores]
Variações
• RT-PCR
• Multiplex PCR
• Nested PCR
Técnicas de amplificação de ácidos
nucleicos
– PCR
– Real Time PCR
– NASBA/TMA
Principio de funcionamento
do Real-Time PCR
Detecção dos
produtos
de PCR
Montar uma reacção
Químicas Utilizáveis
Detcção com SybGreen
Sybr-Green Detection
• Intercalates to dsDNA
• Inhibits DNA
amplification so
concentration is critical
• Detects specific and
non-specific targets
• Low starting background
with large increase in
signal
• Can run a melt curve to
look at product
specificity
Detecção com sondas
Quimicas utilizáveis:
sondas taqman
Quimicas utilizáveis:
molecular beacons
Quimicas utilizáveis:
sondas FRET
TM
Hyb-Probes
Oligo 1: Fluorescein
Oligo 2: Quencher
Transfer
Excitation
Emission
Quimicas utilizáveis:
mgb-probes
F
Q
MGB
F
Q
Aplicações
Quantificação
End Point versus
Real-Time
Quantificação
Aplicações
Detecção de Mutações / SNP
Detecção de mutações
Aplicações
Multiplex Detection
Detecção simultânea de
vários produtos
Os equipamentos
Light Cycler
Smartcycler
Rotorgene
• The samples spin continually during
a run at 500 rpm
• The samples are heated and cooled
in a low mass air oven
• Tubes are illuminated as they pass
the detector
• On data acquisition energy is
averaged over 20 revolutions to give
the fluorescence of each sample
• Four Channels
•
•
•
•
Ch1: ex 470nm, det 510nm
Ch2: ex 530nm, det 550nm
Ch3: ex 585nm, det 610nm
Ch4: ex 625nm, det 660nm
Near-patient-testing
Técnicas de amplificação de ácidos
nucleicos
– PCR
– Real Time PCR
– NASBA/TMA
NASBA/
NUCLISENS
Amplification:
schematic diagram
Primer 1
Legend:
• sense RNA
• antisense RNA
• sense DNA
• antisense DNA
Reverse Transcriptase
RNase H
Primer 2
Reverse Transcriptase
T7 RNA polymerase
Primer 2
Reverse Transcriptase
Reverse Transcriptase
RNase H
Primer 1