Reação de Polimerização em
Cadeia - PCR
1-Introdução
2-Automatização da PCR
3-Sistema de reação
4-Iniciadores – primers
1-Introdução
Kary Mullis
1985 – Cetus Corporation
A PCR é um sistema para a replicação do
DNA in vitro, que permite que uma
seqüência “alvo”de DNA seja amplificada
em milhares de cópias em apenas
algumas horas
2-Automatização da PCR
• O isolamento da DNA polymerase
termoestável da bactéria Thermus
aquaticus, a Taq polymerase.
• Ciclos com oscilações entre altas e baixas
temperaturas, controladas por computador
2-Automatização da PCR
Termociclador
2-Automatização da PCR
Etapas básicas da PCR:
• 1- desnaturação térmica do DNA molde
• 2- Anelamento de oligonucleotídeos
sintéticos – iniciadores
• 3- Polimerização das novas fitas a partir
dos iniciadores
3-Sistema de reação
Em um microtubo...
• DNA a ser amplificado (pequenas
quantidades)
• Solução tamponada contendo:
– DNA polimerase
– Iniciadores
– dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
– Cofator enzimático MgCl2
– Água milliQ
4-Iniciadores - primers
• Tamanho – entre 10 a 30 bases
• Composição de bases - ~50% de
G/C
• Seqüências – não devem ter
complementaridades intra ou inter
molecular
• Cálculo da Tm
4-Iniciadores - primers
Cálculo da Tm - temperatura de anelamento dos
iniciadores
• Do inglês: melting temperature
• Temperatura na qual se tenta obter o equilíbrio
entre a formação e a dissociação dos híbridos
gerados pelo estabelecimento de pontes de
hidrogênio
• Para o cálculo:
• Tm= 2(A+T) + 4(G+C)