Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
Departamento de Saúde Coletiva
Mestrado em Saúde Pública
Avaliação da técnica Nested-PCRTbU para
aplicação no diagnóstico da peste
Gerlane Tavares de Souza
Recife, 2005
Gerlane Tavares de Souza
Avaliação da técnica Nested-PCRTbU para aplicação no
diagnóstico da peste
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em
Saúde Pública do Centro de Pesquisas Aggeu
Magalhães da Fundação Oswaldo Cruz, para
obtenção do Título de Mestre em Saúde Pública,
Área de Controle de Endemias e Métodos de
Diagnóstico de Doenças Infecciosas e Parasitárias.
Orientadora: Profa. Dra. Alzira Maria Paiva de Almeida
Co-Orientadora: Profa. Dra. Nilma Cintra Leal
Recife
2005
Avaliação da técnica Nested-PCRTbU para aplicação no
diagnóstico da peste
Gerlane Tavares de Souza
Comissão Examinadora
_________________________________________
Dra. Alzira Maria Paiva de Almeida
CPqAM/FIOCRUZ (Orientadora)
_________________________________________
Dra. Nilma Cintra Leal
CPqAM/FIOCRUZ (Co-Orientadora)
_________________________________________
Dra. Tereza Cristina Leal Balbino
CPqAM/FIOCRUZ (Membro Interno Titular)
_________________________________________
Dr. Luiz Bezerra de Carvalho Junior
UFPE/LIKA (Membro Externo Titular)
_________________________________________
Dr. Frederico Guilherme Coutinho Abath
CPqAM/FIOCRUZ (Membro Interno Suplente)
_________________________________________
Dra. Marise Sobreira Bezerra da Silva
UPE (Membro Externo Suplente)
Recife, 2005.
Aos meus pais, Clenilson e Cleide, pelo incentivo, compreensão,
orgulho e amor. Agradeço sempre a Deus por tê-los ao meu lado.
Dedico
Agradecimentos
Dra Alzira, obrigada pela confiança e dedicação concedidas a mim desde a Faculdade. Espero
que essa parceria perdure por muito mais tempo. Meus sinceros agradecimentos e admiração.
Dra Nilma, agradeço por toda dedicação e atenção em todos os momentos. Sua ajuda e
orientações foram essenciais na realização deste trabalho.
Agradeço a todos os técnicos e estagiários do Laboratório de Microbiologia pela amizade e
por todos os momentos e experiências compartilhados nesses dois anos.
Isaac Martins, muito obrigada por todo apoio técnico e pela amizade ao longo desses dois
anos.
Agradeço a Dra Tereza Cristina, Dr. Luiz Bezerra de Carvalho, Dra Marise Sobreira e Dr.
Frederico Abath por aceitarem participar desta banca examinadora.
Dr Celso Tavares, muito obrigada pela contribuição na revisão dessa dissertação. “a poesia
deve fazer parte da vida”, “o novo sempre vem...”.
Muito obrigada ao serviço de informática, principalmente a Carlos Augusto e Gilvan Mariano
por toda atenção e ajuda técnica.
Agradeço as amigas Carol e Claudia que não compartilham mais o mesmo laboratório, mas
sempre estão presentes na minha vida.
Agradeço aos amigos do mestrado: Alda, André, Dani, Gisele, Kamila, Luciana, Maristela
Naíde, Rita, Rosy, e Veruska por todos os momentos de dúvidas, angustias, conquistas e
alegrias que passamos juntos. Até mesmo os momentos mais difíceis foram importantes para
nosso longo processo de maturidade científica. Não esqueçam, nosso contrato está assinado!
Marcus Vinícius, muito obrigada pelo amor, carinho, compreensão e amizade nesses nove
anos de convivência. Seu incentivo sempre foi e será muito importante.
Obrigada ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães e aos Departamentos de Saúde Coletiva e
Microbiologia pelo suporte técnico e científico.
Agradeço a CAPES, pelo suporte financeiro.
Resumo
O diagnóstico de certeza da peste baseia-se na identificação e isolamento da Y. pestis pelo
cultivo de material de pacientes humanos, de roedores e suas pulgas. No Brasil, os casos
humanos e as epizootias de peste ocorrem em locais distantes dos centros de diagnóstico. A
competição com a flora cadavérica das carcaças de roedores e procedimentos inadequados de
conservação e transporte das amostras aos laboratórios pode resultar na morte do bacilo e
resultados falso-negativos. As técnicas moleculares apresentam-se como alternativas para
estas situações, particularmente técnicas baseadas em PCR. No presente trabalho foi
otimizada para o diagnóstico da peste a técnica N-PCRTbU que se baseia na separação física
dos primers por imobilização dos primers internos na tampa do microtubo, dispensando a
abertura do mesmo entre as duas etapas de amplificação, o que reduz a possibilidade de falsopositivos pela contaminação cruzada durante a manipulação dos amplicons no Nested-PCR
convencional. Dois pares de primers, dirigidos ao gene estrutural (caf1) do antígeno F1 de Y.
pestis (um par com homologia a uma região mais externa ao alvo e outro com homologia a
uma região mais interna), foram inicialmente testados individualmente por PCR e depois por
N-PCR tendo sido obtidos segmentos de tamanho esperado. Foram estabelecidas as
concentrações de Taq DNA polimerase, dNTPs e MgCl2, bem como a proporção entre os
primers externos e internos para o N-PCRTbU. Nos ensaios para estabelecimento do limiar de
detecção a partir de DNA total e da cultura da cepa Y. pestis P. PB 881 a N-PCRTbU foi
capaz de detectar respectivamente 10 pg de DNA e 20 bactérias viáveis. Baços de
camundongos “Swiss Webster” infectados experimentalmente com a cepa Y. pestis P. PB 881
e amostras de baço, fígado, pulmão e coração conservadas no meio de Cary-Blair por 11
meses foram analisadas em paralelo por cultivo em gelose peptonada e pela técnica NPCRTbU. O fragmento de tamanho esperado (460pb) foi amplificado em todas as amostras
mesmo nas que se revelaram multicontaminadas ou negativas pela cultura. Nos ensaios com
DNA de outras espécies do gênero Yersinia: Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica e com
baços de camundongos não infectados com a Y. pestis não houve amplificação. Além da
especificidade e sensibilidade, como os resultados podem ser obtidos rapidamente, em menos
de 24 horas, a N-PCRTbU poderá ser mais uma opção em situações emergenciais nas quais a
rapidez no diagnóstico é fundamental para adoção de medidas imediatas de controle.
Abstract
Plague diagnosis is based on the identification and isolation of the plague bacilli, Y. pestis, by
culture of human, rodents and flea samples. In Brazil, human cases and plague epizootics
generally occur in areas far from the diagnosis centers. The competition with the cadaveric
flora in carcasses of rodents and inadequate shipment procedures of the samples to the
diagnosis laboratories can result in the death of the bacillus and false-negative results.
Molecular techniques, particularly PCR-based techniques, can circumvent these situations. In
the N-PCRTbU technique the immobilization of the inner primer onto the inside of the
microtubes cap, makes unnecessary opening the tubes between the two steps of amplification.
This procedure reduces the possibility of false-positives by cross-contamination during the
manipulation of the amplicons. In the present work, two pairs of primers, directed to the
structural gene (caf1) of the Y. pestis F1 antigen (a pair with homology to an outer region of
the gene and another one with homology to an inner region), were initially tested by PCR and
later by N-PCR. DNA fragments of the expected sizes were obtained with both primers. Taq
DNA Polymerase, dNTPs and MgCl2 concentrations as well as the ratio between outer and
inner primers for the N-PCRTbU reaction had been established. The detection capacity of NPCRTbU was found to be 20 UFC and 10pg of DNA, for N-PCR was six UFC and 1pg DNA.
PCR shown less sensitive and was unable to detect less than 100pg DNA and 200 UFC from
the strain Y. pestis P. PB 881. In the spleens of experimentally infected mice freshly analyzed,
and in samples of spleen, liver, lung and heart from infected mice preserved in Cary-Blair
medium for 11 months, analyzed in parallel by culture and by the N-PCRTbU technique, the
segment of expected size (460bp) was amplified in all the samples, even in the multicontaminated ones. In the assays with DNA of other species of Yersiniae: Y. enterocolitica
and Y. pseudotuberculosis, and with spleens from non-infected mice there was no
amplification. Besides its sensitivity and specificity the results of N-PCRTbU can be obtained
quickly, in less 24-hour, so this technique could be a good alternative, mainly in emergency
situations in which the rapidity of the diagnosis is critical for the prompt adoption of control
measures.
Lista de figuras e tabelas
Figura 1
Esquema representativo do N-PCRTbU
22
Figura 2
Produtos da N-PCRTbU com DNA da cepa Y pestis P. PB 881 e diferentes 34
concentrações dos primers dirigidos a uma região da extremidade do gene
caf1 (E) e a uma região mais interna (I)
Figura 3
Produtos da PCR (primers externos) com diferentes quantidades de DNA da 35
cepa Y. pestis P. PB 881
Figura 4
Produtos da N-PCR com diferentes quantidades de DNA da cepa Y. pestis P. 36
PB 881
Figura 5
Produtos da N-PCRTbU com diferentes quantidades de DNA da cepa Y. 37
pestis P. PB 881
Tabela 1
Número de bactérias viáveis (unidades formadoras de colônias) da cepa Y. 38
pestis P. PB 881 detectadas por PCR, N-PCR e N-PCRTbU
Tabela 2
Resultados das análises em vísceras de camundongos infectados com a cepa 40
Y. pestis P. PB 881, após 11 meses de conservação no meio de Cary-Blair
Tabela 3
Resultados das análises realizadas a fresco em baços de camundongos 41
infectados com a cepa Y. pestis P. PB 881
Lista de abreviaturas
BAB
Blood Agar Base
BHI
Brain Heart Infusion Broth
CPqAM
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
DNA
Ácido Desoxirribonucléico
DNERu
Departamento Nacional de Endemias Rurais
dNTP’s
Desoxiribonucleotídeos trifosfato
FIOCRUZ
Fundação Oswaldo Cruz
FUNASA
Fundação Nacional de Saúde
HA
Hemaglutinação
ID
Imunofluorescência Direta
Kb
kilobase
M-PCR
Multiplex-PCR
N-PCR
Nested-PCR
N-PCRTbU
Nested-PCR em tubo único
OMS/WHO
Organização Mundial de Saúde/ World Health Organization
OPAS
Organização Panamericana de Saúde
pb
Pares de bases
PCR
Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)
RPM
Rotações por minuto
SNP
Serviço Nacional de Peste
SRP
Serviço de Referência em Peste
SUCAM
Superintendência de Campanhas de Saúde Pública
SVS
Secretaria de Vigilância em Saúde
TBE
Tris-borato; ácido bórico; EDTA
UV
Ultravioleta
UFC
Unidade Formadora de Colônia
Sumário
Dedicatória
Agradecimentos
Resumo
Abstract
Lista de figuras e tabelas
Lista de abreviaturas
Introdução...................................................................................................................
11
Histórico da peste........................................................................................................ 11
Vigilância e controle da peste no Brasil.....................................................................
13
A Yersinia pestis......................................................................................................... 13
Características genéticas............................................................................................
14
Características clínico-epidemiológicas da peste........................................................ 15
Ciclo epidemiológico..................................................................................................
15
Formas clínicas e tratamento....................................................................................... 16
Métodos de diagnóstico..............................................................................................
17
Clínico-epidemiológico............................................................................................... 17
Diagnóstico bacteriológico.........................................................................................
18
Exame direto por coloração pelo azul de metileno.....................................................
18
Imunofluorescência direta........................................................................................... 18
Cultura......................................................................................................................... 18
Teste rápido para pesquisa de F1 (fita reagente)......................................................... 19
Inoculação em camundongos......................................................................................
19
Diagnóstico sorológico...............................................................................................
19
Diagnóstico molecular...............................................................................................
20
PCR.............................................................................................................................
20
Multiplex-PCR (M-PCR) ...........................................................................................
20
Nested-PCR (N-PCR).................................................................................................
21
Nested-PCR em tubo único (N-PCRTbU)..................................................................
21
Justificativas................................................................................................................ 23
Pergunta condutora.....................................................................................................
24
Objetivos.....................................................................................................................
25
Geral............................................................................................................................ 25
Específicos..................................................................................................................
25
Procedimentos metodológicos..................................................................................
26
Desenho de estudo......................................................................................................
26
Bactérias e condições de cultivo.................................................................................
26
Teste com bacteriófago...............................................................................................
26
Extração DNA plasmidial...........................................................................................
27
Extração DNA genômico............................................................................................
27
Avaliação do limiar de detecção do PCR, N-PCR, e N-PCRTbU a partir do DNA
total.............................................................................................................................. 28
Avaliação do Limiar de detecção do PCR, N-PCR, e N-PCRTbU a partir da
cultura.......................................................................................................................... 28
Procedimentos com animais........................................................................................ 29
Ensaios a fresco com baços de camundongos............................................................. 29
Ensaios com amostras conservadas em meio de transporte........................................
29
Primers........................................................................................................................ 30
Avaliação do período de atividade dos primers pré-fixados na tampa do
tubo.............................................................................................................................. 30
PCR e N-PCR.............................................................................................................. 30
N-PCRTbU.................................................................................................................. 31
Avaliação da especificidade da N-PCRTbU...............................................................
32
Resultados...................................................................................................................
33
Avaliação dos primers por PCR e N-PCR..................................................................
33
Estabelecimento da proporção entre primers internos e externos no NPCRTbU..................................................................................................................... 33
Limiar de detecção a partir do DNA total e das suspensões
bacterianas................................................................................................................... 33
Teste de especificidade do N-PCRTbU......................................................................
33
Análise das amostras de vísceras conservadas em Cary-Blair.................................... 39
Análise realizada a fresco em baços de camundongos infectados com a cepa Y.
pestis P. PB 881.......................................................................................................... 39
Avaliação do período de atividade dos primers pré-fixados na tampa do
tubo.............................................................................................................................. 39
Discussão....................................................................................................................
42
Referências bibliográficas........................................................................................... 45
Anexos......................................................................................................................... 51
Artigo..........................................................................................................................
52
Introdução
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 11
Introdução
A peste é uma doença bacteriana de grande magnitude e transcendência na história da
humanidade, cujas características clínicas e epidemiológicas passaram a ser melhor
conhecidas a partir de 1894, durante a pandemia contemporânea. Merecem especial destaque
o isolamento do agente etiológico, Yersinia pestis, por Alexander Yersin em 1894, e a
descoberta do papel da pulga na transmissão da doença por Louis Simond, em 1898
(POLLITZER, 1954), o que possibilitou o desenvolvimento de procedimentos preventivos,
diagnósticos e terapêuticos.
A peste está incluída na classe I do Regulamento Sanitário Internacional (RSI)
vigente, que exige notificação compulsória e vigilância permanente nos focos e nos locais por
onde a infecção possa ser introduzida a partir de países ou continentes com história de peste
(WHO, 1999). O cumprimento do RSI exige que medidas de controle sejam adotadas
imediatamente na vigência de manifestações suspeitas de peste, visando evitar ou minimizar a
repercussão da doença. Para que isto ocorra, a disponibilidade de métodos diagnósticos
rápidos e eficientes é essencial.
Um diagnóstico rápido e preciso é produto de uma série de procedimentos que, em
situações críticas, nem sempre corresponde aos padrões especificados, o que pode repercutir
negativamente no controle da doença. No Brasil, as epizootias e os casos humanos ocorrem
em locais distantes dos centros de diagnóstico e os procedimentos de conservação e transporte
das amostras coletadas para exame podem causar morte dos bacilos da peste e inviabilizar o
diagnóstico pelos métodos tradicionais de cultivo e isolamento da bactéria. O Serviço de
Referência em Peste (SRP) do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM-FIOCRUZ)
vem otimizando e avaliando métodos de diagnósticos moleculares para utilização na rotina de
diagnóstico e, principalmente, em situações emergenciais.
Histórico da peste
Conceitos mais antigos admitiam que a peste teria surgido como doença entre os
primeiros mamíferos placentários no Planalto Central Asiático, considerado o “berço da
peste” (PERRY;FETERSTON, 1997; POLITZER, 1954). Alguns relatos sobre pestilências no
antigo testamento da Bíblia podem ser um indício da ocorrência da peste na era pré-cristã. No
entanto, estudos recentes de Achtman et al.(1999) sugerem que a Y. pestis seria um clone que
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 12
divergiu da Y. pseudotuberculosis a cerca de 1.500-20.000 anos, um pouco antes da primeira
pandemia de peste, pela aquisição de fatores de virulência que contribuíram para adaptação da
Y. pestis a novos hospedeiros, formas de transmissão e patogenia diferentes da Y.
pseudotuberculosis.
Na era cristã, em 542 d.C, a peste tomou grandes proporções resultando na primeira
pandemia ou “Peste de Justiniano”, que se iniciou no Egito e se expandiu ao longo de 60 anos
pela Ásia, África e Europa com alta letalidade. A segunda pandemia ou “Peste negra” teve
início no século XIV na Ásia e se prolongou até o século XVI se alastrando por toda a Europa
(levando ao óbito aproximadamente 25 milhões de pessoas), e norte da África. A terceira
pandemia ou pandemia contemporânea teve seu início na China em 1855, atingiu Hong Kong
em 1894 e de lá se irradiou para os Estados Unidos, América do Sul, África do Sul e
Madagascar, através do transporte marítimo (POLLITZER, 1954).
Segundo Mollaret (1989), a terceira pandemia parou de se expandir durante a II guerra
mundial quando os antigos navios foram afundados e substituídos por modernos navios à
prova de ratos. Porém, esta pandemia deixou vários focos endêmicos em muitos países do
mundo.
A bactéria foi introduzida no Brasil em 1899 pelo porto de Santos no Estado de São
Paulo. Inicialmente atingiu várias cidades litorâneas e a partir de 1906 sofreu interiorização
através das rotas comerciais e finalmente se focalizou entre os roedores silvestres, em áreas
rurais, principalmente na região Nordeste: Alagoas, Bahia, Ceará, norte de Minas Gerais,
Paraíba, Piauí, Pernambuco, Rio Grande do Norte, além de um foco na Serra dos Órgãos no
Estado do Rio de Janeiro.
A ocorrência de uma quarta pandemia, a luz dos conhecimentos disponíveis, é
improvável. Entretanto, epidemias de dimensões imprevisíveis podem ocorrer com o uso da Y.
pestis como arma biológica (INGLESBY et al., 2000), o que teria como principal expressão
clínica a forma pneumônica. O uso de bactérias resistentes a antimicrobianos dificultaria o
tratamento e controle da doença.
Atualmente, a peste está incluída pela OMS entre as doenças reemergentes em
decorrência do aumento de incidência mundial de casos humanos e ocorrência de epidemias
em alguns países (HIGGINS, 2004). Em 2002, 13 países notificaram 1 925 casos de peste
com 177 mortes, em 2003, nove países notificaram 2 118 casos dos quais 182 foram fatais. Os
países mais acometidos foram a República Democrática do Congo e Madagascar, ambos na
África (WHO, 2004).
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 13
Vigilância e controle da peste no Brasil
No Brasil, a luta contra a Peste esteve a princípio a cargo dos Departamentos de Saúde
dos Estados e em 1936 passou à responsabilidade do Departamento Nacional de Saúde. Em
1941, foi criado o Serviço Nacional de Peste (SNP), estruturado especialmente para o
combate dessa infecção em todo o território, integrado sob comando único técnico e
administrativo. A partir de 1956, o SNP passou a fazer parte do Departamento Nacional de
Endemias Rurais (DNERu), posteriormente SUCAM (Superintendência de Campanhas de
Saúde Pública) e FUNASA (Fundação Nacional de Saúde).
Na década de 70 foi criada uma rede de laboratórios distribuídos estrategicamente nas
áreas de peste, com atribuições em diferentes níveis. Foram divididos em laboratórios de
apoio, que tinham a finalidade de coletar e preparar as amostras para exame, e laboratórios
regionais, encarregados de realizar diagnóstico laboratorial.
Com as reformas no Ministério da Saúde e reorganização do Sistema Nacional de
Vigilância, a vigilância da peste que vinha sendo realizada pela FUNASA, foi
descentralizada, passando à responsabilidade dos próprios municípios atingidos por esta
endemia sob a coordenação da Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS). O Serviço de
Referência em Peste do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM), Fundação Oswaldo
Cruz (FIOCRUZ), trabalha integradamente com a SVS e os municípios nesta vigilância.
As atividades de vigilância e controle envolvem a captura sistemática e exames
bacteriológicos dos roedores e seus ectoparasitos para detecção da Y. pestis e a pesquisa de
anticorpos antipestosos através de inquéritos sorológicos entre roedores e carnívoros
domésticos ou silvestres, além do tratamento dos doentes e profilaxia dos comunicantes.
A modernização e desenvolvimento de estratégias de controle e métodos de
diagnóstico rápidos são objetivos primordiais, assim como a sua utilização nas redes de
laboratório de saúde pública, criando-se condições para que o Sistema Único de Saúde (SUS)
dê respostas eficazes às demandas de rotina e mesmo a excepcionalidade de um ataque
terrorista.
A Yersinia pestis
O gênero Yersinia pertence à família Enterobacteriaceae e é constituído de 11 espécies
das quais apenas três são patogênicas para o homem: a Y. pestis, o agente da peste; e as
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 14
espécies Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis que são enteropatógenas. A Y. pestis é um
bacilo curto e ovóide (0,5 a 0,8 µm de diâmetro e de 1 a 3 µm de comprimento), Gramnegativo, imóvel e não formador de esporos; desenvolve-se em temperaturas de 4ºC a 40ºC
com temperatura ótima de crescimento de 28ºC e pH entre 7.2 – 7.6, porém suporta pH entre
5 a 9,6. Após 48 horas de incubação em meio sólido, suas colônias são pequenas,
esbranquiçadas, convexas, brilhantes e translúcidas (PERRY; FETHERSTON, 1997).
A Y. pestis era considerada uma espécie muito homogênea por possuir apenas um
sorotipo, um fagotipo e um biotipo com três biovar ou variedades geográficas, mas estudos de
ribotipagem em cepas de diversos focos do mundo identificaram mais de 16 ribotipos e
mostraram uma correlação entre os ribotipos e os biovars (GUIYOULE et al., 1994;
GUIYOULE et al., 1997).
Os biovars são definidos de acordo com a capacidade de fermentação do glicerol e
redução do nitrato ao nitrito: variedade Antiqua ou Continental (glicerol
+
, nitrato+);
Maedievalis (glicerol +, nitrato-) e Orientalis ou Oceânica (glicerol-, nitrato+), cada biovar
seria remanescente da cada uma das três pandemias respectivamente: Peste de Justiniano,
Peste Negra e Peste Contemporânea (PERRY; FETHERSTON, 1997). Zhou et al.(2004)
sugerem a criação de um quarto biovar “microtus” para incluir cepas chinesas não virulentas
para humanos que fermentam o glicerol e não reduzem o nitrato a nitrito, de forma
semelhante ao biovar Maedievalis, mas que não utilizam a arabinose como todas as outras
cepas.
Características genéticas
O genoma de três cepas de Y. pestis (CO-92, KIM e 91001) foi seqüenciado (DENG et
al., 2002; PARKHILL et al., 2001; SONG et al., 2004) e foram encontradas significantes
diferenças entre elas resultantes de rearranjos do DNA.
Cepas típicas de Y. pestis possuem um cromossomo de aproximadamente 4.600 kb e
três plasmídeos: pFra (90-100 kb), pYV (70 kb) e pPst (9,5 kb) (DENG et al., 2002;
PARKHILL et al., 2001; SONG et al., 2004).
O pFra codifica uma proteína capsular ou fração F1 com atividade antifagocítica (DU
et al., 2002) e a toxina murina (Ymt) que parece estar envolvida na transmissão da peste pelas
pulgas (HINNEBUSCH, 2002a). A expressão da F1 depende de vários genes organizados em
um operon (f1), envolvidos na regulação (caf1R), estrutura (caf1), transporte (caf1M) e
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 15
montagem (caf1A) da proteína (GALYOV et al., 1990; GALYOV et al., 1991;
KARLYSHEV et al., 1992a ; KARLYSHEV et al., 1992b). A F1 é imunogênica para homens
e animais, sendo amplamente utilizada em testes de diagnóstico de peste (CHU, 2000).
O pPst codifica para a proteína Pla que é precursora do ativador do plasminogênio e da
coagulase (SODEINDE; GOGUEN, 1988) que parecem atuar na disseminação da bactéria no
organismo do hospedeiro a partir do sítio da picada da pulga e no bloqueio do trato digestivo
das pulgas respectivamente (CAVANAUGH, et al., 1971; HINNEBUSCH, 2003).
O plasmídeo pYV é o único encontrado nas três espécies de yersínias patogênicas. É
indispensável à virulência das cepas e confere as bactérias a capacidade de superar as defesas
do organismo hospedeiro através da expressão de proteínas antifagocíticas Yop e de um
complexo sistema de secreção tipo III (CORNELIS, 2002).
O cromossomo possui uma região de 102 kb conhecida como locus pgm que contém
dois segmentos física e funcionalmente distintos: um segmento de aquisição de ferro,
considerado uma ilha de patogenicidade (HPI) que possui genes envolvidos na aquisição do
ferro, e um segmento de pigmentação (locus hms) responsável pela estocagem do ferro
evidenciado pelo fenótipo de pigmentação vermelho das colônias quando cultivadas em meios
ricos em hemina ou corantes análogos. O locus hms parece estar envolvido na colonização do
proventrículo da pulga, contribuindo para transmissão (CARNIEL et al., 2001;
HINNEBUSCH et al., 1996).
A Y. pestis possui cerca de 90% de homologia genética com Y. pseudotuberculosis
(BERCOVIER et al., 1980), porém estas duas espécies produzem quadros clínicos bastante
distintos: enquanto a Y. pseudotuberculosis causa transtornos entéricos raramente fatais e é
transmitida via oral-fecal, a Y. pestis adquiriu a capacidade de ser transmitida por um
artrópode-vetor e pode ser letal. Estas diferenças podem ser justificadas pela presença dos
dois plasmídeos específicos em Y. pestis, pFra e pYV, que teriam sido adquiridos
horizontalmente, além da inativação de alguns genes nessa espécie como o gene da adesina,
importante para colonização do trato intestinal (ACHTMAN et al., 1999).
Características clínico-epidemiológicas da peste
Ciclo epidemiológico
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 16
Souza, G.T.
A cadeia epidemiológica da peste é complexa e envolve diferentes populações de
roedores e pulgas, e acidentalmente acomete o homem. Em graus variáveis todos os roedores
são susceptíveis à infecção pestosa. Existe evidência da infecção pela Y. pestis nas ordens
Carnivora, Insectivora, Artiodactyla, Marsupialia, Hyracoidea, e Primata. As aves, répteis e
anfíbios são resistentes a infecção pela Y. pestis, no entanto as aves podem participar na
disseminação da doença pelo transporte de pulgas infectadas (GAGE; KOSOY, 2004).
A transmissão ao homem e roedores é realizada principalmente pela picada da pulga
infectada que pode funcionar como vetor mecânico ou biológico (GAGE; KOSOY, 2004).
Na transmissão biológica, a pulga suga o sangue infectado que, ao chegar nas porções
anteriores do tubo digestivo, sofre coagulação. As bactérias presentes no coágulo se
multiplicam formando uma massa bacilar que bloqueia o estômago da pulga impedindo a
digestão do sangue. Durante as tentativas de se alimentar, a pulga relaxa os músculos
sugadores regurgitando o sangue contaminado no novo hospedeiro propagando a infecção
(HINNEBUSH, 2003).
Na transmissão mecânica, a bactéria é introduzida pelas peças bucais (probóscides)
contaminadas, quando o inseto que foi interrompido em seu repasto sobre um animal doente
passa a picar, em seguida, um animal sadio (GAGE; KOSOY, 2004). Piolhos e carrapatos
podem adquirir a Y. pestis, mas a capacidade vetora desses invertebrados não foi comprovada
experimentalmente (PERRY; FETHERSTON, 1997).
Os animais domésticos, cães e gatos, infectam-se principalmente durante a caça de
roedores infectados e desenvolvem a infecção pestosa na faringe, posteriormente nos pulmões
passando a transmitir a doença através de aerossóis (PERRY; FETHERSTON, 1997).
Formas clínicas e tratamento
A peste no homem se manifesta sob três formas clínicas principais: a bubônica, forma
clínica mais comum, caracterizada pela tumefação inflamatória dos linfonodos que drenam o
local da picada da pulga. Esta pode ser confundida com linfadenites por estreptococos ou
estafilococos,
mononucleose
infecciosa,
filariose
linfática,
doenças
sexualmente
transmissíveis e outras causas de linfadenopatia aguda; a septicêmica, que pode ser primária
ou secundária à forma bubônica. Na forma primária há presença de bacteremia, mas
geralmente não há bubão palpável. A forma secundária ocorre na fase terminal da forma
bubônica não tratada. A bactéria se dissemina por órgãos e tecidos, causando coagulação
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 17
intravascular e choque endotóxico e pode ser confundida com outras causas de sepsis; e a
peste pneumônica, que evolui de forma grave e fatal se não tratada adequadamente podendo
ser transmitida por via aerógena sem a necessidade do vetor (PERRY; FETHERSTON, 1997).
Entre 1970 e 1993, 12% dos casos nos Estados Unidos (77 casos) desenvolveram peste
pneumônica secundária a forma bubônica ou septicêmica da doença (PERRY;
FETHERSTON, 1997). Deve-se realizar diagnóstico diferencial da peste pneumônica com
outras doenças como antraz, tularemia e estreptococcias.
A peste pode se apresentar sob formas clínicas mais raras como: peste faringiana,
oftálmica e meningeal. Existem ainda relatos de uma forma benigna ou “pestis minor” com
discreto comprometimento ganglionar e cura espontânea (ALMEIDA et al, 2003; PERRY;
FETHERSTON, 1997).
O tratamento da peste deve ser iniciado o mais precocemente possível e os antibióticos
de escolha são os aminoglicosídeos, as tetraciclinas e as fluoroquinolonas. O cloranfenicol
está indicado principalmente nas meningites e endoftalmites. As penicilinas e macrolídeos
não são eficazes (PERRY; FETHERSTON, 1997).
Uma cepa de Y. pestis multirresistente aos antibióticos de primeira linha utilizados no
tratamento e profilaxia da peste foi isolada em Madagascar. A resistência foi atribuída à
aquisição de um plasmídeo de resistência a antibióticos. Existem várias hipóteses para
explicar a aquisição deste plasmídeo, uma delas é que foi adquirido no organismo dos ratos
(Rattus rattus), animal onívoro, que convive em ambientes contaminados com material fecal
humano com flora resistente a antibióticos (DENNIS; HUGHES, 1997; GALIMAND et al.,
1997). Em outra hipótese, a bactéria teria adquirido o plasmídeo de resistência no sistema
digestivo de pulgas que ingerem sangue contaminado com ambos os microorganismos, o
doador e o receptor do plasmídeo de resistência (HINNEBUSH et al., 2002b).
Métodos de diagnóstico
Clínico-epidemiológico
O diagnóstico clínico-epidemiológico é baseado na correlação de variáveis clínicas e
epidemiológicas de um caso. Este diagnóstico pode ser útil em situações em que não é
possível o isolamento do agente etiológico e em diagnósticos retrospectivos.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 18
Souza, G.T.
Diagnóstico bacteriológico
Exame direto por coloração pelo azul de metileno
Esse teste evidencia a morfologia bipolar da Y. pestis: coloração clara no centro e bem
corada nas extremidades. Pode ser realizado a partir de esfregaços feitos a partir de sangue,
aspirado de bubão, líquido cefalorraquidiano, esputo no homem ou sangue, baço, medula
óssea e fígado dos animais infectados. Um inconveniente da técnica é a dificuldade de
identificação da bactéria em amostras multicontaminadas (ALMEIDA et al., 2003).
Imunofluorescência direta
A imunofluorescência direta (ID) é uma técnica de diagnóstico que se baseia na reação
antígeno-anticorpo
empregando
anticorpos
conjugados
com
material
fluorescente
(isotiocianato de fluoresceínana, FITC) para pesquisa da proteína capsular F1 de Y. pestis em
esfregaços de cultura e material de origem humana ou animal (CHU, 2000). Apesar deste
método ser utilizado na rotina dos programas no Center for Disease Control and Prevention
(CDC) dos Estados Unidos da América (EUA), ainda não foi adotado na rotina de diagnóstico
e vigilância no Brasil, principalmente pelo fato do conjugado não ser produzido
comercialmente.
Cultura
As diversas amostras de material humano, de animais ou de pulgas são cultivadas em
placas de gelose peptonada ou base de agar sangue (Blood Agar Base: BAB) a 28ºC, pH na
faixa de 7,4 a 7,6. O crescimento é lento e após 48hs as colônias são pequenas, translúcidas,
brilhantes e possuem a particularidade de serem deslocadas sem nenhuma alteração
morfológica com a alça de platina.
O cultivo da bactéria em caldo (brain heart infusion broth: BHI) é feito nas mesmas
condições de temperatura e pH utilizadas para a gelose peptonada. O crescimento após 24 a
48 hs apresenta aspecto flocular sem turvação do meio. A repicagem em caldo e posterior
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 19
plaqueamento com teste de bacteriófago podem ser realizados para confirmação de colônias
com morfologia característica de Y. pestis crescidas em cultivos multicontaminados (CHU,
2000).
O diagnóstico por cultura pode ser prejudicado pelas condições de transporte e
conservação das amostras que podem estar multicontaminadas ou conter bactérias inviáveis,
acarretando resultado falso negativo.
Teste rápido para pesquisa de F1 (fita reagente)
Chanteau et al. (2003) desenvolveram um teste imunocromatográfico tipo fita reagente
que utiliza anticorpos monoclonais anti-F1 imobilizados junto a uma substância cromógena
em membranas de nitrocelulose. É de fácil e rápida execução dispensando eletricidade,
equipamentos ou refrigeração das amostras. É realizado com a imersão da fita em amostras de
sangue, esputo, aspirado de bubão de pacientes. A leitura do resultado é simples e é revelada
por uma reação cromatrográfica. No entanto, a distribuição deste teste ainda é restrita.
Inoculação em camundongos
A inoculação em camundongos é particularmente útil quando se deseja recuperar a Y.
pestis de amostras multicontaminadas. As amostras são suspensas em salina e inoculadas no
animal que será observado durante duas semanas para verificação dos sintomas ou morte. A
necropsia e posterior cultura de vísceras possibilitam a recuperação da Y. pestis e confirma o
diagnóstico, no entanto é uma alternativa demorada (CHU, 2000).
Diagnóstico sorológico
A técnica de hemaglutinação (HA) utiliza o antígeno F1 imobilizado em hemácias de
carneiro para detectar anticorpos específicos em soros humanos, de roedores e carnívoros
(CHU, 2000). No entanto, esta técnica apresenta inconvenientes como complexidade e
emprego de reagentes perecíveis.
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 20
Diversos testes empregando novas matrizes sensibilizadas com a F1 foram
desenvolvidos, porém estas técnicas exigem a utilização de diferentes anticorpos espécieespecífico nos testes com soros humanos, de roedores, cães e gatos (ALMEIDA; FERREIRA,
1992; ARAUJO et al., 1998; BARBOSA, et al., 2000; CARVALHO-JR et al, 1996; LIMABARROS et al., 2002; MONTENEGRO et al., 1993 THULLIER et al., 2003). Uma técnica de
aglutinação em grânulos de látex sensibilizados com a F1 foi desenvolvida no CDC (CHU,
2000); é de fácil execução e de boa reprodutibilidade podendo ser aplicada em soros de
qualquer origem. Rodrigues et al.(1999) desenvolveram um teste de aglutinação de
micropartícula de PVA/GA (Álcool Polivinílico/Glutaraldehido) que são estáveis e de baixo
custo. No entanto, a síntese das partículas de PVA/GA não apresentou reprodutibilidade em
ensaios subseqüentes. A HA continua sendo o teste mais usado no diagnóstico e vigilância da
peste em todo mundo.
Diagnóstico molecular
PCR
A técnica de PCR baseia-se na amplificação “in vitro” de segmentos específicos de
DNA, permitindo um rápido diagnóstico em diversas doenças bacterianas, virais, parasitárias
e hereditárias (ERLICHI et al., 1991). A PCR mostrou-se útil na identificação de patógenos
em amostras conservadas em museus (PERSING et al., 1990) e de Y. pestis em amostras
arqueológicas (DRANCOURT et al., 1998). Diversos protocolos baseados na PCR têm sido
desenvolvidos para diagnóstico da peste em material clínico ou animal (CHU, 2000;
ENGELTHALER et al, 1999; RAHALISON et al, 2000).
Multiplex-PCR (M-PCR)
A M-PCR é uma técnica na qual são utilizados múltiplos pares de primers dirigidos a
diferentes alvos numa mesma reação. Leal e Almeida (1999) desenvolveram um protocolo
para diagnóstico e tipagem de Y. pestis usando primers específicos para os genes caf1, lcrV e
pla localizados respectivamente nos plasmídeos pFra, pYV e pPst e para o gene cromossomal
irp2. Esta técnica mostrou-se útil para estudos retrospectivos da peste (MELO et al., 2003).
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 21
Nested-PCR (N-PCR)
A N-PCR é uma variação da PCR adotada para melhorar a sensibilidade e
especificidade da PCR (ERLICHI et al., 1991). O procedimento é realizado em duas etapas de
amplificação: na primeira é utilizado um par de primers com homologia a uma região mais
externa ao alvo e posteriormente, os amplicons gerados na primeira reação servem como
molde para a segunda etapa que utiliza primers dirigidos a uma região mais interna ao
primeiro produto. Leal et al.(1996) adaptaram a técnica para o diagnóstico da peste em baços
de roedores sem a necessidade de extração prévia do DNA da bactéria.
Nested-PCR em tubo único (N-PCRTbU)
A N-PCRTbU é uma variação do N-PCR adaptada para minimizar riscos de
contaminação durante a transferência dos amplicons entre as etapas de amplificação no NPCR (ERLICHI et al., 1991). Nesta técnica, os dois pares de primers, internos e externos, são
adicionados ao mesmo tubo sem a necessidade de abertura do tubo entre as fases de
amplificação.
Para evitar a competição entre os dois pares de primers pelo alvo no N-PCRTbU,
foram desenvolvidas algumas estratégias baseadas no uso de diferentes temperaturas de
anelamento para cada par de primers (GOOKIN et al., 2002; HERRMANN et al.,1996) ou na
separação física dos primers (BERG et al., 2001).
Abath et al.(2002) desenvolveram a estratégia de fixar os primers internos na face
interna da tampa do microtubo, por evaporação. Para facilitar a visualização dos primers
fixados, traços do corante azul de bromofenol são adicionados aos primers internos antes da
fixação, dando a eles uma coloração azul. A mistura de reação com os primers externos é
introduzida no interior do tubo e ao final da primeira etapa de amplificação o tubo é invertido
várias vezes de modo que o primer fixado na tampa dissolva-se no produto da primeira reação
(figura 1). Montenegro et al.(2004) adaptaram esta técnica para detecção de Plasmodium, com
adição de primers direcionados para DNA humano como controle para detectar falso
negativos por presença de inibidores.
22
Figura 1: Esquema representativo do N-PCRTbU
Primers internos + azul de bromofenol
Primers externos +
Mistura de reação
1ª etapa: atuação
dos primers externos
Diluição dos primers
fixados
2ª etapa: atuação dos
primers internos
Justificativas
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 23
Souza, G.T.
Justificativas
•
A peste está incluída pela OMS entre as doenças reemergentes em decorrência do
aumento de incidência mundial de casos humanos e ocorrência de epidemias em
alguns países (HIGGINS, 2004).
•
Embora desde 1997 não tenha sido isolada nenhuma cepa de Y. pestis, os
inquéritos sorológicos vêm detectando anticorpos antipestosos nos animais
sentinelas em vários focos (ARAGÃO et al., 2002) confirmando a manutenção da
circulação da infecção nos focos brasileiros, e em fevereiro de 2005 foi confirmado
sorologicamente um caso humano no município de Pedra Branca no Estado do
Ceará.
•
Na vigilância da peste é necessário o emprego de métodos de diagnóstico rápidos e
eficientes para que medidas de controle sejam adotadas rapidamente a fim de
evitar sua propagação entre a população humana.
•
O cultivo e isolamento da Y. pestis podem ser prejudicados pela conservação e
transporte inadequados das amostras coletadas para exames. As técnicas baseadas
em PCR podem ser uma alternativa para identificação da Y. pestis em amostras
dessecadas e multicontaminadas.
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 24
Pergunta condutora:
Qual o desempenho da técnica Nested-PCRTbU para diagnóstico da peste sob condições
experimentais?
Objetivos
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 25
Souza, G.T.
Objetivos
Geral
Avaliar a técnica Nested-PCRTbU para aplicação no diagnóstico da peste.
Específicos
•
Otimizar as concentrações dos reagentes utilizados no N-PCRTbU
•
Avaliar o limiar de detecção no N-PCRTbU a partir de DNA total e da cultura
bacteriana comparando-o ao da PCR e N-PCR
•
Avaliar o desempenho da N-PCRTbU na identificação da Y. pestis em material
de roedores analisado a fresco e após conservação no meio de transporte de
Cary-Blair, comparando-o ao da PCR e N-PCR
Procedimentos
metodológicos
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 26
Procedimentos metodológicos
Desenho de estudo
Não foi possível o enquadramento desta dissertação em nenhum desenho de pesquisa
epidemiológica, porém a avaliação de testes potencialmente mais eficientes em relação aos
existentes é de grande importância para a epidemiologia.
Bactérias e condições de cultivo
Foi utilizada a cepa Y. pestis P. PB 881 isolada em 1986 da hemocultura de um
paciente humano do Estado da Paraíba (ALMEIDA et al., 1989). A cepa é conservada em
camada alta de gelose em câmara fria (4ºC) na bacterioteca do Departamento de
Microbiologia do CPqAM. Para os trabalhos, a cepa foi reativada por semeio em caldo (Brain
Heart Infusion Broth: BHI, Difco), incubada a 28ºC por 48 horas e em seguida semeada em
gelose peptonada (Blood Agar Base: BAB, Difco). A confirmação da pureza foi realizada pela
sensibilidade ao fago antipestoso. Após a reativação, a cepa foi analisada quanto ao conteúdo
plasmidial para verificar a presença do alvo das reações moleculares (plasmídeo pFra).
Também foi utilizado o DNA total das cepas Y. pestis P. CE 882, Y.
pseudotuberculosis IP 32450e Y. enterocolitica 25C.
Teste com bacteriófago
Após 48 a 72 horas de cultivo em placa, 2 ou 3 colônias com morfologia característica
de Y. pestis foram repicadas individualmente para caldo (BHI) e incubadas a 28ºC por 24
horas. Uma alíquota de cada crescimento em BHI foi plaqueada em BAB e em um local
demarcado da placa foi adicionado o bacteriófago, seguido de incubação a 28ºC. A
sensibilidade ao fago é caracterizada por um halo de lise visualizado após 18-24h no local
onde o fago foi adicionado.
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 27
Extração do DNA plasmidial
Para confirmar a presença dos três plasmídeos prototípicos (pFra, pYV e pPst), o DNA
plasmidial da cepa Y. pestis P. PB 881 foi extraído pela técnica de lise alcalina segundo
protocolo de Birnboim e Doly (1979) modificado na Escola Paulista de Medicina.
Um mililitro da cultura em BHI foi centrifugado a 4ºC a 12.000rpm. Ao sedimento foi
adicionado 100µl da solução de lise (Tris-HCL 25mM, EDTA 10mM, glicose 20mM,
lisozima 0,4mg), incubando-se à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida foi
adicionado 200µl de solução alcalina (SDS 1%, NaOH 0,2N), incubando-se por 10 minutos
em banho de gelo, para completar a lise das células bacterianas. A solução foi neutralizada
com 150µl de acetato de sódio 3M pH 4,8 e incubada por 30 minutos em banho de gelo. Após
10 minutos de centrifugação, o sobrenadante foi transferido para outro tubo e a ele foi
adicionado 400µl de fenol-clorofórmio-álcool isoamilico (25:24:1) para purificação do DNA.
Os tubos foram centrifugados, o sobrenadante recuperado e precipitado com 900µl de álcool
etílico a –70ºC por 30 minutos, seguido por centrifugação por 10 minutos. Após descarte do
sobrenadante, o precipitado foi ressuspenso em 10µl de água deionizada estéril.
O DNA obtido foi submetido à eletroforese em gel de agarose 0,6% em tampão TBE
(Tris-borato 0,089; ácido bórico 0,089M; EDTA 0,002M), a 100V, corado por imersão do gel
em solução de brometo de etídio (15mg/ml) e visualizado sob luz UV. O tamanho dos
plasmídeos foi determinado por comparação com a migração de plasmídeos de tamanhos
conhecidos (147; 63; 35,8 e 6,9kb) da cepa E. coli 39R861.
Extração do DNA genômico
O DNA genômico foi extraído a partir de um mililitro da cultura em BHI que foi
centrifugado a 12.000rpm em centrífuga refrigerada (4ºC). O sobrenadante foi descartado, e o
sedimento suspenso em 500µl de TE, novamente centrifugado, desprezado o sobrenadante e
ao precipitado foi adicionado: 500µl de TE, 10µl de lisozima (10mg/ml) e 10µl de proteinase
K (5mg/ml). Após homogeneização, a suspensão foi incubada a 60ºC por 20 minutos para
início da lise bacteriana, em seguida foi adicionado 100µl de STE (SDS 2,5%, Tris-HCl
10nM pH8,0; EDTA 0,25M). Depois de 15 minutos de incubação a 60ºC, os tubos foram
mantidos por 5 minutos a temperatura ambiente e por 5 minutos em banho de gelo e
neutralizada com 130 µl de acetato de amônio 7,5M, permanecendo no banho de gelo por
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 28
mais 15 minutos e centrifugada por 5 minutos. Aproximadamente 700µl de sobrenadante foi
transferido para outro tubo, adicionado o mesmo volume de fenol-clorofórmio-álcool
isoamílico (25:24:1), e centrifugado por 5 minutos. Os sobrenadantes foram novamente
transferidos para outros tubos e o DNA precipitado com aproximadamente 420µl de
isopropanol a -70ºC por 30 minutos ou a -20 por 24 horas. Após centrifugação, o
sobrenadante foi descartado. Os precipitados foram ressuspensos em 10µl de solução de
RNAse (10mg/ml) e conservados a -20ºC.
A qualidade do DNA obtido foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 1% em
tampão TBE, como já descrito. A quantificação do DNA foi realizada em espectofômetro
(Eppendorf).
Avaliação do limiar de detecção do PCR, N-PCR e N-PCRTbU a partir do DNA total
Para o estabelecimento do limiar de detecção das técnicas de PCR (primers internos e
externos), N-PCR e N-PCRTbU, o DNA foi diluído nas concentrações de 0.5ng, 50pg, 5pg,
500fg, 50fg e 5 fg/µl. Foram utilizados 2µl de cada diluição nas reações, correspondendo a
1ng, 100pg, 10pg, 1pg, 100fg e 10fg de DNA.
Avaliação do limiar de detecção do PCR, N-PCR e N-PCRTbU a partir da cultura
Cem microlitros da cultura em BHI da cepa Y. pestis P. PB 881 foram centrifugados
por 5 minutos a 12.000 rpm e o sedimento suspenso em 1000µl de salina estéril. Foram feitas
diluições seriadas (1:10) em salina até 10 -8. 100µl das diluições 10-4 a 10-8 foram plaqueadas
para contagem das Unidades Formadoras de Colônia (UFC) e o restante submetido à fervura
por 10 minutos para lise bacteriana. Dez microlitros das diluições 10-4 a 10-8 fervidas foram
utilizados diretamente nas reações de PCR, N-PCR e N-PCRTbU.
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 29
Procedimentos com animais
Sete camundongos albinos “Swiss Webster” obtidos no Biotério Central do CPqAM
foram inoculados por via subcutânea com 0,2 ml de suspensão bacteriana da cepa Y. pestis P.
PB 881 em salina estéril (cerca de 2x105 células bacterianas). Os animais foram mantidos em
sala climatizada com água e ração (Nuvital), supervisionados diariamente, e após a morte,
foram necropsiados para coleta de amostras para as análises. Fragmentos de vísceras (baço,
fígado, pulmão, coração) de um animal foram introduzidos no meio de conservação e
transporte de Cary-Blair (CARY; BLAIR, 1964) e mantidos a temperatura ambiente para
análises posteriores, paralelamente foram submetidos à cultura para confirmação da presença
da Y. pestis. Baços de seis animais foram analisados logo após a coleta (a fresco).
Ensaios a fresco com baços de camundongos
Fragmentos de baços de seis camundongos foram triturados em salina estéril. Uma
alíquota dos sobrenadantes foi semeada em BAB para confirmação da presença da Y. pestis e
o restante submetido a um processo de purificação parcial para neutralização dos inibidores da
reação de PCR segundo protocolo descrito em Leal e Almeida (1999) baseado em Mahbubani
e Bej (1994): 500µl de cada amostra (triturado de vísceras a fresco ou em Cary-Blair) foi
centrifugado, o sedimento lavado em 1000µl de TE (Tris-HCl 10mM; EDTA 1mM) pH 8,0 e
centrifugado. O sedimento foi ressuspenso em 100 µl de tampão K (KCl 50mM; Tris-HCL
20mM pH 8,3; MgCl 2,5mM), a mistura foi incubada a 55ºC por 1 hora, em seguida a 95ºC
por 10 minutos e congelada uma vez. Dez microlitros de cada amostra processada foram
utilizados nas reações de PCR, N-PCR e N-PCRTbU.
Ensaios com amostras conservadas em meio de transporte
Após 11 meses de conservação em Cary-Blair, fragmentos de baço, pulmão, coração e
fígado foram processados para purificação parcial como descrito acima e analisados por PCR,
N-PCR e N-PCRTbU. As amostras foram novamente submetidas à cultura em gelose
peptonada.
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 30
Primers
Para amplificação do gene caf1 (GALYOV et al. 1990) foram utilizados dois pares de
primers direcionados a regiões diferentes da seqüência do gene, disponível do Gen Bank (nº
de acesso X61996)
•
Primers externos: 5’-CAG TTC CGT TAT CGC CAT TGC 3’ e 5’ TAT TGG TTA
GAT ACG GTT ACG GT-3’ (NORKINA et al., 1994)
•
Primers internos: 5’-TTG GAA CTA TTG CAA CTG CTA 3’ e 5’ TTA GAT ACG
GTT ACG GTT A-3’ (LEAL et al., 1996).
Vinte picomoles de cada primer (externos e internos) foram testados individualmente
por PCR utilizando 20ng de DNA da cepa Y. pestis P. PB 881 e posteriormente testados por
N-PCR.
Para as reações de N-PCRTbU, o par de primer interno foi aplicado na face interna dos
microtubos juntamente com traços do corante azul de bromofenol adicionado para facilitar a
visualização da diluição do primer na mistura (figura 1). Os tubos foram mantidos abertos em
cabine de segurança biológica por aproximadamente 40 minutos para fixação dos primers por
evaporação.
Avaliação do período de atividade dos primers pré-fixados na tampa dos tubos
Os tubos com primers fixados foram mantidos sob refrigeração (–20ºC) e usados no
período de três meses para verificar a duração do período de atividade.
PCR e N-PCR
As reações de PCR foram realizadas num volume total de 25µl por tubo, contendo:
2µl das diluições do DNA total ou 10µl das suspensões bacterianas ou 10µl das amostras
processadas; Tris-HCL 10mM pH 8,0; KCl 50mM; MgCl2 1,5 mM; 20 pmoles de primers;
1U da enzima Taq DNA polimerase (Amersham Bioscience); dNTP’s: dATP, dCTP, dGTP e
dTTP 200µM. Em cada ensaio de PCR ou N-PCR, foi incluído um controle negativo (apenas
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 31
a mistura de reação, sem adicionar DNA como molde) e um controle positivo (adição de 20
ng de DNA total da cepa Y. pestis P. PB 881).
As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra Trio Thermoblock) e
cada ciclo de amplificação foi composto por 1 minuto a 92ºC para desnaturação, 1 minuto a
55ºC para anelamento dos primers e 1 minuto a 72ºC para extensão num total de 30 ciclos
seguidos de uma etapa final de extensão de 7 minutos a 72ºC.
As reações de Nested-PCR foram realizadas nas mesmas condições de reação já
citadas, com 2 µl do produto das reações de PCR e 20pmol do primer interno.
Os produtos das amplificações foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%
como já descrito. O tamanho dos segmentos amplificados foi determinado por comparação
com segmentos de tamanhos conhecidos do marcador “100 pb DNA ladder” (Amersham).
N-PCRTbU
Foram realizados ensaios com diferentes quantidades dos primers externos (20; 2; 1;
0,1; 0,01 e 0,001 pmoles) e 20 pmoles dos internos.. A proporção 1:10, correspondendo a
concentração de 2 pmol de primers externos e 20 pmoles de primers internos, foi a que
proporcionou melhor resultado e foi adotada para continuação dos trabalhos. Também foram
realizados ensaios para determinar as concentrações de dNTP, MgCl2 e Taq DNA polimerase.
As reações foram realizadas num volume total de 50µl em tubos com 20 pmoles de
primers internos pré-fixados contendo: 2µl das diluições do DNA total ou 10µl das
suspensões bacterianas ou 10µl das amostras processadas; Tris-HCL 20mM pH 8,0; KCl
100mM; MgCl 3mM; 2 U da enzima Taq DNA polimerase; dNTP’s: dATP, dCTP, dGTP e
dTTP 400µM e 2 pmoles de primer externo.
As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra trio thermoblock). A
primeira etapa consistiu de 15 ciclos compostos de 1 minuto a 90ºC, 1 minuto a 55ºC e 1
minuto a 72ºC. Após a primeira fase de amplificação os tubos foram aquecidos a 90ºC por
aproximadamente dois minutos e em seguida invertidos várias vezes para diluição do primer
fixado na tampa do microtubo, na mistura de reação. Os tubos foram brevemente
centrifugados e submetidos à segunda fase de amplificação composta por 45 ciclos de 1
minuto a 90ºC, 1 minuto a 55ºC e 1 minuto a 72ºC seguidos de uma etapa de extensão final de
7 minutos a 72ºC.
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 32
Os produtos da N-PCRTbU foram submetidos a eletroforese como descrito
anteriormente.
Avaliação da especificidade da N-PCRTbU
A especificidade da reação foi avaliada através de ensaios de amplificação com 20ng
do DNA total das cepas Y. pestis P. PB 881 e P. CE 882 e com outras espécies do gênero
Yersinia: Y. pseudotuberculosis IP 32450 e Y. enterocolitica 25C e em triturados de baços de
camundongos normais (não inoculados) cedidos pelo biotério do CPqAM, conduzidos nas
mesmas condições de amplificação empregadas para Y. pestis.
Os produtos das amplificações foram analisados por eletroforese como descrito
anteriormente.
Resultados
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 33
Resultados
Avaliação dos primers por PCR e N-PCR
Nas reações de PCR utilizando 20ng de DNA da cepa Y. pestis P. PB 881 e 20 pmoles
de primers externos ou internos houve amplificação dos segmentos de tamanho esperado: 506
e 460 pb respectivamente. No N-PCR realizado a partir do PCR com primers externos, o
fragmento de 460 pb foi amplificado.
Estabelecimento da proporção entre primers internos e externos para N-PCRTbU
Das proporções de primers testadas, a que produziu banda melhor definida foi a de 2
pmol de primer externo para 20 pmol de primer interno (1:10). Esta proporção foi adotada na
continuação dos trabalhos (figura 2, linha 3).
Limiar de detecção a partir de DNA total e das suspensões bacterianas
Nas reações usando como molde o DNA extraído da cepa Y. pestis P. PB 881 nas
quantidades de 1ng, 100pg, 10pg, 1pg, 100fg e 10fg houve amplificação até 100pg para PCR
com primers internos (dados não mostrados) e com primers externos, 1pg para N-PCR e 10 pg
para N-PCRTbU (figuras 3, 4 e 5).
A tabela 1 mostra a quantidade mínima de bactérias viáveis (unidades formadoras de
colônias) da cepa Y. pestis P. PB 881 detectadas por PCR (primer externo), N-PCR e NPCRTbU.
Teste de especificidade do N-PCRTbU
Não houve amplificação a partir do DNA total das cepas Y. pseudotuberculosis IP
32450 e Y. enterocolitica Ye25C, nem com as amostras de baços de camundongos normais,
não inoculados. Com o DNA das cepas Y. pestis P. CE 882 e P. PB 881 foi amplificado o
segmento de tamanho esperado (dados não mostrados).
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 34
Souza, G.T.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
800pb
460pb
Figura 2. Produtos da N-PCRTbU com DNA da cepa Y. pestis P. PB 881 e diferentes
concentrações dos primers dirigidos a uma região da extremidade do gene caf1 (E) e a uma
região mais interna (I). Linhas 1: 100pb DNA Ladder, 2: 20pmol E x 20 pmol I, 3: 2pmol E x
20 pmol I, 4: 1pmol E x 20 pmol I, 5: 0,1 pmol E x 20 pmol I, 6: 0,01 pmol E x 20 pmol I, 7:
0,001 pmol E x 20 pmol I, 8: 0pmol E x 20 pmol I, 9: 20pmol E x 0 pmol I, 10: controle
negativo.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 35
Souza, G.T.
1 2 3 4
5 6
7
8
9
800pb
506pb
Figura 3. Produtos da PCR (primers externos) com diferentes quantidades de DNA da cepa Y.
pestis P. PB 881. Linhas 1: 100pb DNA ladder, 2: 1ng, 3: 100pg, 4: 10pg, 5: 1pg, 6: 100fg, 7:
10fg, 8: controle negativo, 9: controle positivo.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 36
Souza, G.T.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
800pb
460pb
Figura 4. Produtos da N-PCR com diferentes quantidades de DNA da cepa Y. pestis P. PB 881.
Linhas 1: 100pb DNA ladder, 2: 1ng, 3: 100pg, 4: 10pg, 5: 1pg, 6: 100fg, 7: 10fg, 8: controle
negativo do PCR, 9: controle positivo do PCR, 10: controle negativo do N-PCR; 11: controle
positivo do N-PCR
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 37
Souza, G.T.
1 2
3
4
5 6
7
8
9
800pb
460pb
Figura 5. Produtos da N-PCRTbU com diferentes quantidades de DNA da cepa Y. pestis P. PB 881.
Linhas 1: 100pb DNA ladder, 2: 1ng, 3: 100pg, 4: 10pg, 5: 1pg, 6: 100fg, 7: PCR primer interno, 8: PCR
primer externo, 9: controle negativo.
Tabela 1 Número de bactérias viáveis (unidades formadoras de colônias) da cepa Y. pestis P. PB 881 detectadas por PCR, N-PCR e NPCRTbU
Diluições
UFC/10µl
PCR
N-PCR
N-PCRTbU
10-4
2 x 103
+
+
+
10-5
2 x 102
-
+
+
10-6
2 x 101
-
+
+
10
-7
0
2 x 10
-
+
-
10
-8
0
-
-
-
38
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 39
Análise de amostras de vísceras conservadas em Cary-Blair
Das quatro amostras (baço, fígado, pulmão, coração) plaqueadas em gelose peptonada
após conservação por 11 meses no meio de Cary-Blair, duas apresentaram crescimento puro
da Y. pestis e duas foram invadidas por crescimento de bactérias e fungos contaminantes. Em
uma das culturas contaminadas havia colônias características de Y. pestis confirmadas pelo
teste com o bacteriófago e na outra o crescimento dos contaminantes foi intenso
inviabilizando o teste com o fago sendo considerada negativa. Houve amplificação dos
segmentos esperados por N-PCR e N-PCRTbU nas quatro amostras independente da presença
de contaminantes nas culturas. Nos ensaios por PCR houve amplificação apenas nas duas
amostras que produziram culturas puras (tabela 2).
Análises realizadas a fresco em baços de camundongos infectados com a cepa Y. pestis P.
PB 881
Das culturas dos baços dos seis animais inoculados com a cepa Y. pestis P. PB 881,
apenas uma revelou crescimento de cultura pura de Y. pestis, nas demais foram obtidas
culturas mistas com crescimento de contaminantes além das colônias características de Y.
pestis confirmadas pelo teste com fago. Em todas houve amplificação do segmento esperado
por N-PCR e N-PCRTbU e em apenas três por PCR. Os resultados dessas análises estão
sumarizados na tabela 3.
Avaliação do Período de atividade dos primers pré-fixados na tampa dos tubos
A atividade dos primers pré-fixados foi mantida durante os três meses de uso.
Tabela 2 Resultados das análises em vísceras de camundongos infectados com a cepa Y. pestis P. PB 881, após 11 meses de
conservação no meio de Cary & Blair
Material
Cultura
Fago
PCR
N-PCR
N-PCRTbU
Baço
Multicontaminada
+
-
+
+
Fígado
Multicontaminada
Não realizado
-
+
+
Pulmão
Pura Y. pestis
+
+
+
+
Coração
Pura Y. pestis
+
+
+
+
40
Tabela 3 Resultados das análises realizadas a fresco em baços de camundongos infectados com a cepa Y. pestis P. PB 881
Número das amostras
Cultura
Fago
PCR
N-PCR
N-PCRTbU
1.
Multicontaminada
+
-
+
+
2.
Multicontaminada
+
+
+
+
3.
Multicontaminada
+
+
+
+
4.
Multicontaminada
+
-
+
+
5.
Pura Y. pestis
+
+
+
+
6.
Multicontaminada
+
-
+
+
CN
Multicontaminada
-
-
-
-
CN
Sem crescimento
NR
-
-
-
CN: Controle Negativo (baço de camundongo não inoculados)
NR: Não Realizado
41
Discussão
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 42
Discussão
Embora desde 1997 a Y. pestis não tenha sido mais isolada através dos estudos
bacteriológicos realizados em pulgas e roedores, os inquéritos sorológicos têm detectado a
presença de anticorpos antipestosos nos animais sentinela (cães e gatos) em vários focos
(ARAGÃO et. al., 2002) e em fevereiro de 2005 foi detectado sorologicamente um caso
humano no município de Pedra Branca no Estado do Ceará.
No Brasil, a maioria dos casos humanos e as epizootias pestosas ocorrem em áreas
remotas e afetam comunidades com condições sanitárias e de comunicação precárias, longe
dos laboratórios de diagnóstico. Os procedimentos usados na conservação e transporte das
amostras coletadas para exames nos laboratórios podem acarretar o dessecamento e
contaminação das amostras levando a morte da Y. pestis.
O meio de Cary-Blair (1964) foi originalmente desenvolvido para conservação e
transporte de material fecal e foi demonstrado por Cavanaugh (1967) que é capaz de manter a
viabilidade do bacilo da peste por semanas a temperatura ambiente tendo sido adotado na
rotina do Programa de Controle de Peste. Entretanto os resultados mostraram que a
recuperação da Y. pestis nas amostras conservadas no Cary-Blair é inferior do que quando as
amostras são analisadas logo após a coleta (ALMEIDA et al 1988).
Técnicas moleculares apresentam a vantagem de dispensar o cultivo das amostras e
são exeqüíveis mesmo quando as bactérias estão inviáveis. Diversos protocolos baseados na
PCR têm sido desenvolvidos para diagnóstico da peste em material clínico ou animal (CHU,
2000; ENGELTHALER et al, 1999; RAHALISON et al, 2000).
A N-PCR é útil quando se pretende aumentar a sensibilidade da PCR. Um processo
rápido e simples de identificação da Y. pestis por N-PCR diretamente em baços de roedores
foi desenvolvido por Leal et al.(1996).
Um inconveniente da N-PCR é a possibilidade de contaminação cruzada no momento
de transferência dos amplicons da primeira para a segunda etapa de amplificação.
Para minimizar o risco de contaminações na N-PCR têm sido propostas técnicas
realizadas em um único tubo. Nelas, é importante a utilização de estratégias que evitem a
competição entre os dois pares de primers pelo alvo. Para evitar esta competição, algumas
propostas são baseadas na utilização de primers que atuem em temperaturas diferentes
(GOOKIN et al., 2002; HERRMANN, et al., 1996) ou na separação física dos primers no
interior do tubo de reação (ABATH et al., 2002; BERG et al., 2001). A utilização de
temperaturas de anelamento diferentes na N-PCRTbU pode acarretar a amplificação de
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 43
segmentos inespecíficos que podem confundir o diagnóstico, além de requererem confecção
de primers especiais. A alternativa de separação física dos primers utilizada por Berg e col
(2001), baseia-se na separação dos mesmos por uma barreira de óleo de silicone no interior do
tubo, porém essa barreira pode ser rompida por trepidações do termociclador ou mesmo da
bancada onde está instalado misturando os primers e possibilitando competição entre eles.
No nosso trabalho, foi otimizada para o diagnóstico da peste, a técnica N-PCRTbU
que se baseia na separação física dos primers pela imobilização dos primers internos na tampa
do microtubo (ABATH et al., 2002)
Outro requisito importante na NPCRTbU é a utilização completa dos primers externos
na primeira fase de amplificação para evitar competição pelo alvo com os primers internos na
segunda fase de amplificação. No presente estudo, a concentração adequada dos primers
externos foi determinada através de ensaios com diferentes concentrações desses primers
tendo sido determinada a proporção de 2 pmol de primer externo e 20 pmol de primer interno.
A estabilidade dos primers internos pré-fixados na face interna dos microtubos
contribui para aumentar a rapidez da técnica. A etapa de fixação requer pelo menos 40
minutos, mas em vista da estabilidade dos primers pré-fixados a temperatura ambiente (Abath
e col 2002) ou pelo menos por três meses a –20ºC como mostrado no presente trabalho os
tubos poderão ser preparados previamente e armazenados para uso quando necessário.
Nos ensaios com as suspensões bacterianas só houve amplificação pela PCR em
suspensões com 2000 UFC, a N-PCRTbU amplificou a partir de 20 UFC e a N-PCR a partir
de duas UFC. Considerando-se que ao morrer um roedor susceptível pode apresentar >106
bactérias/ml de sangue (BUTLER, 1983) o número no material dos roedores é superior ao
mínimo detectado pela N-PCR e N-PCRTbU no presente trabalho.
A partir do DNA total da cepa de peste, o limiar de detecção da N- PCRTbU (10pg)
foi inferior ao do N-PCR (1pg) porém superior ao da PCR (100pg).
Embora não tenha apresentado maior sensibilidade nos ensaios com DNA total ou com
as suspensões bacterianas, nas análises com material de camundongos realizadas a fresco ou
após conservação no meio de Cary-Blair a N-PCRTbU teve desempenho semelhante ao da NPCR com a vantagem de que confere maior segurança contra contaminações em relação ao NPCR por não ser necessário a abertura do microtubo entre as duas etapas de amplificação.
A eficácia das técnicas N-PCR e N-PCRTbU foi superior a da PCR que só foi capaz
de detectar o bacilo da peste em 50% das amostras quer os ensaios tenham sido realizados a
fresco ou após conservação. Essas técnicas mostraram-se mais eficazes para detecção da Y.
pestis mesmo nas amostras multicontaminadas.
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 44
Convém salientar que na rotina das atividades de vigilância da peste o prazo entre a
coleta das amostras dos roedores, transporte para os laboratórios de diagnósticos e análises, é
de cerca de três semanas ou até mais. No caso dos pacientes humanos ou na vigência de
epizootias este período é mais reduzido. No presente trabalho as amostras foram conservadas
no Cary-Blair por 11 meses o que não é usual nos procedimentos de rotina.
Apesar da alta homologia genética da Y. pestis com a Y. pseudotuberculosis (90%) e
com a Y. enterocolitica (48%) (Bercovier et al., 1980) os primers foram desenhados para
amplificar regiões específicas da Y. pestis que não tem homologia com as outras duas
espécies. Não houve amplificação a partir do DNA dessas espécies e também não houve
amplificação nas reações com os baços dos camundongos não infectados comprovando a
especificidade da técnica.
Conclui-se que o N-PCRTbU constitui uma boa ferramenta para as atividades de vigilância
epidemiológica da peste, pois permite o diagnóstico em situações em que os procedimentos
clássicos poderiam ter o desempenho prejudicado, reduzindo-se a possibilidade de resultados
falso-negativos, e por conseguinte, evitando-se os transtornos médico-sociais decorrentes da
detecção tardia de casos de peste.
A imobilização dos primers internos na face interna da tampa do microtubo dispensa a
abertura dos mesmos o que reduz a possibilidade de resultados falso-positivos pela
contaminação durante a manipulação dos amplicons obtidos na primeira reação. Além da
sensibilidade e especificidade a N-PCRTbU confere maior segurança contra contaminações
em relação ao N-PCR por não ser necessário a abertura do microtubo entre as duas etapas de
amplificação e como os resultados podem ser obtidos rapidamente, em menos de 24 horas, a
N-PCRTbU poderá ser mais uma opção em situações emergenciais nas quais a rapidez no
diagnóstico é fundamental para adoção de medidas imediatas de controle.
Referências
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Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 45
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Anexos
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 51
Anexo
ARTIGO
AVALIAÇÃO DA TÉCNICA NESTED-PCR EM TUBO ÚNICO NO DIAGNÓSTICO
DA PESTE
G. T. de Souza, N. C. Leal, F. G. C. Abath e A. M. P. de Almeida
Departamento de Microbiologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – FIOCRUZ/MS,
Recife (PE), Brasil
Manuscrito a ser submetido para publicação na revista
Letters in Applied Microbiology
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 52
AVALIAÇÃO DA TÉCNICA NESTED-PCR EM TUBO ÚNICO NO DIAGNÓSTICO
DA PESTE
G.T. de Souza, N.C. Leal, F. G. C. Abath e A.M.P. de Almeida
Departamento de Microbiologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães - FIOCRUZ/MS,
Recife, PE, Brasil
___________________________________________________________________
RESUMO
G.T. de Souza, F. G. C. Abath, N.C. Leal e A.M.P. de Almeida
Objetivos: Avaliar a técnica N-PCRTbU para aplicação no diagnóstico da peste.
Métodos e Resultados: Foram realizados ensaios com a cepa Y. pestis P. PB 881 e dois
pares de primers dirigidos ao gene estrutural (caf1) do antígeno F1 da Y. pestis: um par
com homologia a uma região mais externa do gene (primers externos) e outro com
homologia a uma região mais interna (primers internos). Os primers internos foram
imobilizados na face interna da tampa do microtubo e depois da primeira amplificação
foram adicionados ao produto da reação pela simples inversão dos tubos. A N-PCRTbU
foi capaz de detectar 10pg de DNA e 20 bactérias viáveis. Nas análises de vísceras de
camundongos infectados, realizadas a fresco ou após conservação no meio de Cary-Blair,
o segmento de tamanho esperado (460pb) foi amplificado por N-PCRTbU em todas as
amostras mesmo nas que se revelaram multicontaminadas. Não houve amplificação nos
ensaios com DNA de outras espécies do gênero Yersinia e com amostras de baço de
camundongos não infectados.
Conclusão, Significância e Impacto dos Resultados: A N-PCRTbU mostrou-se eficaz
para identificação da Y. pestis em amostras multicontaminadas. A imobilização dos
primers internos na face interna da tampa do microtubo dispensa a abertura dos mesmos o
que reduz a possibilidade de resultados falso-positivos pela contaminação durante a
manipulação dos amplicons obtidos na primeira reação. Além da sensibilidade e
especificidade, como os resultados podem ser obtidos em menos de 24 horas, a NPCRTbU poderá ser mais uma opção em situações emergenciais nas quais a rapidez no
diagnóstico é fundamental para adoção de medidas imediatas de controle.
___________________________________________________________________
Palavras chave: diagnóstico, N-PCRTbU, peste, Y. pestis
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 53
Introdução
A peste (infecção pela Yersinia pestis) é uma zoonose bacteriana primordialmente dos
roedores transmitida pelas pulgas, que pode atingir o homem e outros mamíferos (Gage and
Kosoy, 2004). Nos últimos anos o número de casos humanos vem aumentando mundialmente,
levando a Organização Mundial de Saúde (OMS) a enquadrar a peste entre as doenças
reemergentes (Higgins, 2004). No Brasil, onde nenhum caso humano havia sido confirmado
laboratorialmente desde 1997 (Aragão et al, 2002), um novo caso foi registrado recentemente,
em fevereiro de 2005, no Estado do Ceará. Além disso, os resultados dos inquéritos
sorológicos nos focos têm detectado a presença de anticorpos antipestosos entre os animais
sentinela comprovando a circulação da Y. pestis nessas áreas.
A peste é uma doença de notificação obrigatória internacional e deve permanecer sob
vigilância constante. Isto implica na disponibilidade de métodos rápidos e eficientes de
diagnóstico nos diversos tipos e condições das amostras coletadas para exames. O diagnóstico
de certeza para a peste é o isolamento da Y. pestis por cultivo que pode ser realizado a partir
de amostras de sangue, aspirado de bubão, esputo, medula óssea (peste humana), sangue,
vísceras (baço, fígado, pulmão), ossos de roedores e pulgas. Além de demandar vários dias o
cultivo e isolamento da bactéria podem ser prejudicados pela contaminação das amostras ou
pela morte das bactérias nos procedimentos usados para a conservação e transporte das
amostras dos locais de coleta para os laboratórios de diagnóstico. O Serviço de Referência em
Peste (SRP) do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM) vem desenvolvendo e
avaliando métodos alternativos de diagnóstico para aplicação na metodologia do programa de
vigilância da peste.
Vários métodos moleculares como a PCR e Nested-PCR (N-PCR) têm sido propostos
para o diagnóstico da peste (Campbel et al. 1993; Engelthaler et al. 1999; Leal et al. 1996;
Leal and Almeida 1999). O N-PCR é útil quando se deseja melhorar a sensibilidade da PCR; é
um procedimento realizado em duas etapas de amplificação: na primeira é utilizado um par de
primer com homologia a uma região mais externa ao alvo, posteriormente, os amplicons
gerados na primeira reação servem como molde para a segunda etapa que utiliza primers
dirigidos a uma região mais interna ao primeiro produto. Apesar da N-PCR ser mais sensível
em relação a PCR, existe risco de contaminação durante a transferência dos amplicons da
primeira reação para a segunda etapa de amplificação podendo gerar resultados falsopositivos. Para minimizar este risco, Abath et al. (2002) desenvolveram uma técnica de NPCR em um só tubo (N-PCRTbU), na qual os primers internos são imobilizados na face
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 54
interna da tampa do microtubo e depois da primeira amplificação são adicionados ao produto
da reação pela simples inversão dos tubos dispensando a abertura dos mesmos.
No presente trabalho foram realizados ensaios para otimização da N-PCRTbU para
aplicação no diagnóstico da peste.
MATERIAIS E MÉTODOS
Bactérias e condições de cultivo
Foi utilizada a cepa Y. pestis P. PB 881 da bacterioteca do Departamento de Microbiologia do
CPqAM (Almeida et al 1989). Para os trabalhos, a cepa foi reativada por semeio em brain
heart infusion broth (BHI, Difco), incubada a 28ºC por 48 horas e em seguida plaqueada em
blood agar base (BAB, Difco). Após reativação, a cepa foi testada quanto a sensibilidade ao
fago antipestoso (Karimi, 1974) e analisada quanto ao conteúdo plasmidial (Leal et al, 1996).
Também foi utilizado o DNA total das cepas Y. pestis P. CE 882, Y.
pseudotuberculosis IP 32450e Y. enterocolitica 25C.
Extração do DNA genômico
Um mililitro da cultura em BHI foi centrifugado a 12.000rpm a 4ºC, o sobrenadante foi
descartado, o sedimento suspenso em 500µl de TE e novamente centrifugado. O sobrenadante
foi desprezado, o precipitado homogeneizado com 500µl de TE, 10µl de lisozima (10mg/ml)
e 10µl de proteinase K (5mg/ml). A suspensão foi incubada a 60ºC por 20 minutos seguido da
adição de 100µl de STE (SDS 2,5%, Tris-HCl 10nM pH8,0; EDTA 0,25M), 15 minutos de
incubação a 60ºC, 5 minutos a temperatura ambiente e 5 minutos em banho de gelo. A
suspensão foi neutralizada com 130 µl de acetato de amônio 7,5M, mantida no banho de gelo
por mais 15 minutos e depois centrifugada por 5 minutos. Aproximadamente 700µl de
sobrenadante foi transferido para outro tubo, adicionado o mesmo volume de fenolclorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1) e centrifugado por 5 minutos. O sobrenadante foi
transferido para outro tubo e o DNA precipitado com aproximadamente 420µl de isopropanol
a -70ºC por 30 minutos ou a -20 por 24 horas seguido de centrifugação e descarte do
sobrenadante. O precipitado foi ressuspenso em 10µl de solução de RNAse (10mg/ml) e
conservado a -20ºC.
A qualidade do DNA obtido foi avaliada através de eletroforese em gel de agarose a
0,6% em tampão TBE (Tris-borato 0,089; ácido bórico 0,089M; EDTA 0,002M), a 100V e
visualização sob luz UV após coloração em solução de brometo de etídio (15mg/ml) e a
quantificação foi realizada em espectofotômetro (Eppendorf).
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 55
Procedimentos com animais
Sete camundongos albinos “Swiss Webster” obtidos no Biotério Central do CPqAM foram
inoculados por via subcutânea com 0,2 ml de suspensão bacteriana da cepa Y. pestis P. PB
881 em salina estéril (cerca de 2x105 células bacterianas). Os animais foram mantidos em sala
climatizada com água e ração (Nuvital), supervisionados diariamente, e após a morte, foram
necropsiados para coleta de amostras para as análises. Fragmentos de vísceras (baço, fígado,
pulmão, coração) de um animal foram introduzidos no meio de conservação e transporte de
(Cary and Blair, 1964) e mantidos a temperatura ambiente para análises posteriores,
paralelamente foram submetidos à cultura para confirmação da presença da Y. pestis. Baços
de seis animais foram analisados logo após a coleta (a fresco).
Para análises, as amostras foram trituradas e suspensas em salina estéril, centrifugadas
e os sobrenadantes submetidos a um processo de purificação parcial para neutralização dos
inibidores da reação de PCR segundo protocolo descrito em Leal e Almeida (1999) baseado
em Mahbubani e Bej (1994): 500µl de cada amostra (triturado de vísceras a fresco ou em
Cary-Blair) foi centrifugado, o sedimento lavado em 1000µl de TE (Tris-HCl 10mM; EDTA
1mM) pH 8,0 e centrifugado. O sedimento foi ressuspenso em 100 µl de tampão K (KCl
50mM; Tris-HCL 20mM pH 8,3; MgCl 2,5mM), a mistura foi incubada a 55ºC por 1 hora,
em seguida a 95ºC por 10 minutos e congelada uma vez. Dez microlitros de cada amostra
processada foram utilizados nas reações de PCR, N-PCR e N-PCRTbU.
Uma alíquota dos sobrenadantes foi plaqueada em BAB para confirmação da presença
da Y. pestis.
Avaliação do limiar de detecção das técnicas PCR, N-PCR e N-PCRTbU
O DNA da cepa de peste foi diluído em água deionizada estéril nas concentrações de 0.5ng,
50pg, 5pg, 500fg, 50fg e 5 fg/µl e 2µl de cada diluição foram utilizados nas reações,
correspondendo a 1ng, 100pg, 10pg, 1pg, 100fg e 10fg de DNA.
Foram feitas diluições seriadas (1:10) em salina até 10
–8
a partir de uma cultura em
BHI da cepa de peste, 100µl das diluições 10-4 a 10-8 foram plaqueadas para contagem das
Unidades Formadoras de Colônia (UFC) e o restante submetido à fervura por 10 minutos para
lise bacteriana. Dez microlitros das diluições 10-4 a 10-8 fervidas foram utilizados diretamente
nas reações de PCR, N-PCR e N-PCRTbU.
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 56
Primers
Para amplificação do gene caf1 (Galyov et al. 1990) foram utilizados dois pares de primers:
Primers externos: 5’-CAG TTC CGT TAT CGC CAT TGC 3’ e 5’ TAT TGG TTA GAT
ACG GTT ACG GT-3’ (Norkina et al. 1994) e Primers internos: 5’-TTG GAA CTA TTG
CAA CTG CTA 3’ e 5’ TTA GAT ACG GTT ACG GTT A-3’ (Leal et al. 1996).
Vinte picomoles de cada primer (externos e internos) foram testados individualmente
por PCR utilizando 20ng de DNA da cepa de peste e posteriormente por N-PCR.
Para as reações de N-PCRTbU, o par de primer interno foi aplicado na face interna dos
microtubos juntamente com traços do corante azul de bromofenol adicionado para facilitar a
visualização após fixação. Os tubos foram mantidos abertos em cabine de segurança biológica
por aproximadamente 40 minutos para fixação dos primers por evaporação do diluente e
depois fechados e guardados a –20ºC até o momento do uso.
PCR e N-PCR
As reações de PCR foram realizadas num volume total de 25µl por tubo, contendo: 2µl das
diluições do DNA total, 10µl das suspensões bacterianas ou 10µl das amostras processadas;
Tris-HCL 10mM pH 8,0; KCl 50mM; MgCl2 1,5 mM; 20 pmoles de primers; 1U da enzima
Taq DNA polimerase (Amersham Bioscience); dNTP’s: dATP, dCTP, dGTP e dTTP 200µM.
Em cada ensaio foi incluído um controle negativo (mistura de reação, sem DNA molde) e um
controle positivo (20 ng de DNA total da cepa Y. pestis P. PB 881).
As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra Trio Thermoblock)
programado para 30 ciclos de 1 minuto a 92ºC, 1 minuto a 55ºC e 1 minuto a 72ºC seguido
por 7 minutos a 72ºC na primeira etapa de amplificação.
A Nested-PCR foi realizada com 2 µl do produto das reações de PCR e 20pmol do
primer interno nas condições descritas.
Os produtos das amplificações foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%
como descrito. O tamanho dos segmentos amplificados foi determinado por comparação com
o marcador “100 pb DNA ladder” (Amersham).
N-PCRTbU
Foram realizados ensaios para determinar as concentrações de dNTP, MgCl2 e Taq DNA
polimerase e com diferentes proporções entre primers externos e internos. Melhores
resultados foram obtidos com 2 pmoles de primer externo e 20 pmoles de primer interno
(1:10) e foi adotada para continuação dos trabalhos.
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 57
As reações foram realizadas num volume total de 50µl contendo: 2µl das diluições do
DNA total, 10µl das suspensões bacterianas ou 10µl das amostras processadas; Tris-HCL
20mM pH 8,0; KCl 100mM; MgCl 3mM; 2 U da enzima Taq DNA polimerase; dNTP’s:
dATP, dCTP, dGTP e dTTP 400µM e 2 pmoles de primer externo.
As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra trio thermoblock). A
primeira etapa de amplificação consistiu de 15 ciclos compostos de 1 minuto a 90ºC, 1 minuto
a 55ºC e 1 minuto a 72ºC. Após a primeira etapa os tubos foram aquecidos a 90ºC por cerca
de dois minutos e em seguida invertidos várias vezes para diluição do primer fixado na tampa
do microtubo, na mistura de reação. Os tubos foram brevemente centrifugados e submetidos à
segunda amplificação composta por 45 ciclos de 1 minuto a 90ºC, 1 minuto a 55ºC e 1 minuto
a 72ºC seguidos de 7 minutos a 72ºC para extensão final.Os produtos das amplificações foram
analisados por eletroforese como descrito.
Ensaios com DNA de uma cepa de Y. pseudotuberculosis (IP 32450) e Y.
enterocolitica (25C) e triturados de baços de camundongos não infectados foram conduzidos
nas mesmas condições empregadas para Y. pestis.
RESULTADOS
Limiar de detecção a partir de DNA total e das diluições bacterianas
Nas reações usando como molde o DNA extraído da cepa de peste houve amplificação até
100pg para PCR, 1pg para N-PCR e 10 pg para N-PCRTbU (tabela 1).
O mínimo de bactérias viáveis detectadas pela N-PCR foram 2 UFC, 20 UFC por NPCRTbU e 2000 UFC pela PCR (tabela 1).
Análise de vísceras de camundongos realizadas a fresco ou após conservação no meio de
Cary-Blair
Das quatro amostras (baço, fígado, pulmão, coração) plaqueadas em gelose peptonada após
conservação por 11 meses no meio de Cary-Blair, duas apresentaram crescimento puro da Y.
pestis e duas foram invadidas por crescimento de bactérias e fungos contaminantes. Em uma
das culturas contaminadas havia colônias características de Y. pestis confirmadas pelo teste
com o bacteriófago e na outra o crescimento dos contaminantes foi intenso inviabilizando o
teste com o fago sendo considerada negativa. Houve amplificação dos segmentos esperados
por N-PCR e N-PCRTbU nas quatro amostras independente da presença de contaminantes nas
culturas. Nos ensaios por PCR houve amplificação apenas nas duas amostras que produziram
culturas puras (tabela 2).
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 58
Das culturas dos baços dos seis animais inoculados com a cepa Y. pestis P. PB 881,
apenas uma foi positiva por cultura pura, as demais foram positivas, mas foram obtidas
culturas mistas com crescimento de contaminantes. Em todas houve amplificação do
segmento esperado por N-PCR e N-PCRTbU e em apenas três por PCR (tabela 2).
Não houve amplificação com os baços dos camundongos normais, não inoculados
(tabela 2).
Teste de especificidade do N-PCRTbU
Não houve amplificação a partir do DNA total das cepas Y. pseudotuberculosis IP
32450e Y. enterocolitica Ye25C, nem das amostras de baços de camundongos normais (não
inoculados).
DISCUSSÃO
No Brasil a maioria dos casos humanos e as epizootias pestosas ocorrem em áreas
remotas e afetam comunidades com condições sanitárias e de comunicação precárias, longe
dos laboratórios de diagnóstico. Os procedimentos usados na conservação e transporte das
amostras coletadas para exames nos laboratórios podem acarretar a contaminação das
amostras e a morte dos bacilos de peste levando a resultados falso-negativos.
Técnicas moleculares apresentam a vantagem de dispensar o cultivo das amostras e
são exeqüíveis mesmo quando as bactérias estão inviáveis. Diversos protocolos baseados na
PCR têm sido desenvolvidos para diagnóstico da peste em material clínico ou animal (Chu,
2000; Engelthaler et al, 1999; Rahalison et al, 2000; Leal et al 1996; Leal & Almeida (1999).
A N-PCR embora mais sensível que a PCR convencional tem como inconveniente a
possibilidade de contaminação cruzada no momento de transferência dos amplicons da
primeira para a segunda etapa de amplificação. Para minimizar o risco de contaminações na
N-PCR têm sido propostas técnicas realizadas em um único tubo. Nelas, é importante a
utilização de estratégias que evitem a competição entre os dois pares de primers pelo alvo.
Para evitar esta competição, algumas propostas são baseadas na utilização de primers que
atuem em temperaturas diferentes (Gookin et al., 2002; Herrmann, et al., 1996) ou na
separação física dos primers no interior do tubo de reação (Abath et al., 2002; Berg et al.,
2001). A utilização de temperaturas de anelamento diferentes na N-PCRTbU pode acarretar a
amplificação de segmentos inespecíificos que podem confundir o diagnóstico, além de
requererem confecção de primers especiais. A alternativa de separação física dos primers
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 59
utilizada por Berg et al (2001), baseia-se na separação dos mesmos por uma barreira de óleo
de silicone no interior do tubo, porém essa barreira pode ser rompida por trepidações do
termociclador ou mesmo da bancada onde está instalado misturando os primers e
possibilitando competição entre eles. Neste trabalho, foi otimizada para o diagnóstico da
peste, a técnica N-PCRTbU que se baseia na separação física dos primers pela imobilização
dos primers internos na tampa do microtubo (Abath et al 2002).
Outro requisito importante na NPCRTbU é a utilização completa dos primers externos
na primeira fase de amplificação para evitar competição pelo alvo com os primers internos na
segunda fase de amplificação. No presente estudo a concentração adequada dos primers
externos foi determinada através de ensaios com diferentes concentrações desses primers
tendo sido determinada a proporção de 2 pmol de primer externo e 20 de primer interno.
A estabilidade dos primers internos pré-fixados na face interna dos microtubos
contribui para aumentar a rapidez da técnica. A etapa de fixação requer pelo menos 40
minutos, mas em vista da estabilidade dos primers pré-fixados a temperatura ambiente (Abath
et al 2002) ou pelo menos por três meses a –20ºC como mostrado no presente trabalho os
tubos poderão ser preparados previamente e armazenados para uso quando necessário.
Nos ensaios com as suspensões bacterianas só houve amplificação pela PCR em
suspensões com mais de 2000 UFC, a N-PCRTbU amplificou a partir de 20 UFC e a N-PCR a
partir de duas UFC. Considerando-se que ao morrer um roedor susceptível pode apresentar
>106 bactérias/ml de sangue o número no material dos roedores é superior ao mínimo
detectado pela N-PCR e N-PCRTbU neste trabalho. A partir do DNA total da cepa de peste, o
limiar de detecção da N- PCRTbU (10pg) foi inferior ao do N-PCR (1pg) porém superior ao
da PCR (100pg).
Embora não tenha apresentado maior sensibilidade nos ensaios com DNA total ou com
as suspensões bacterianas, nas análises com material de camundongos realizadas a fresco ou
após conservação no meio de Cary-Blair a N-PCRTbU teve desempenho semelhante ao da NPCR com a vantagem de que confere maior segurança contra contaminações em relação ao NPCR por não ser necessário a abertura do microtubo entre as duas etapas de amplificação.
A eficácia das técnicas N-PCR e N-PCRTbU foi superior a da PCR que só foi capaz
de detectar o bacilo da peste em 50% das amostras quer os ensaios tenham sido realizados a
fresco ou após conservação. Essas técnicas mostraram-se eficazes para detecção da Y. pestis
mesmo em amostras multicontaminadas.
Convém salientar que na rotina das atividades de vigilância da peste o prazo entre a
coleta das amostras dos roedores, transporte para os laboratórios de diagnóstico e as análises
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 60
duram cerca de três semanas ou até mais. No caso dos pacientes humanos ou na vigência de
epizootias este período é mais reduzido. No presente trabalho as amostras foram conservadas
no Cary-Blair por 11 meses o que não é usual nos procedimentos de rotina.
Apesar da alta homologia genética da Y. pestis com a Y. pseudotuberculosis (90%) e
com a Y. enterocolitica (48%) (Bercovier et al., 1980) os primers foram desenhados para
amplificar regiões específicas da Y. pestis que não tem homologia com as outra duas espécies.
Não houve amplificação a partir do DNA dessas espécies e também não houve amplificação
nas reações com os baços dos camundongos não infectados comprovando a especificidade da
técnica.
Conclui-se que o N-PCRTbU constitui uma boa ferramenta para as atividades de vigilância
epidemiológica da peste, pois permite o diagnóstico em situações em que os procedimentos
clássicos poderiam ter o desempenho prejudicado, reduzindo-se a possibilidade de resultados
falso-negativos, e por conseguinte, evitando-se os transtornos médico-sociais decorrentes da
detecção tardia de casos de peste.
A imobilização dos primers internos na face interna da tampa do microtubo dispensa a
abertura dos mesmos o que reduz a possibilidade de resultados falso-positivos pela
contaminação durante a manipulação dos amplicons obtidos na primeira reação. Além da
sensibilidade e especificidade a N-PCRTbU confere maior segurança contra contaminações
em relação ao N-PCR por não ser necessário a abertura do microtubo entre as duas etapas de
amplificação e como os resultados podem ser obtidos rapidamente, em menos de 24 horas, a
N-PCRTbU poderá ser mais uma opção em situações emergenciais nas quais a rapidez no
diagnóstico é fundamental para adoção de medidas imediatas de controle.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Yara Nakazawa, Silvana Santos, Fabio Melo e a Roberto Werkhauser,
pelo apoio e ajuda técnica no presente trabalho.
Souza, G.T.
Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 61
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Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 63
Souza, G.T.
Tabela 1 Comparação do limiar de detecção das técnicas PCR, N-PCR e NPCRTbU a partir de DNA total e UFC da cepa Y. pestis P. PB 881.
PCR
N-PCR
N-PCRTbU
UFC
>2 x 102
2 x 101
2 x 102
DNA
100pg
1pg
10pg
UFC: Unidades Formadoras de Colônia
pg: picogramas
Tabela 2 Análises em material de camundongos infectados experimentalmente com a cepa Y. pestis P. PB 881 realizadas a fresco e
após conservação em Cary-Blair
Amostra
Cultura
Fago
PCR
N-PCR
N-PCRTbU
Baço
Multicontaminada
+
-
+
+
Fígado
Multicontaminada
Não realizado
-
+
+
Pulmão
Pura
+
+
+
+
Coração
Pura
+
+
+
+
Multicontaminada
+
-
+
+
Multicontaminada
+
+
+
+
Multicontaminada
+
+
+
+
Multicontaminada
+
-
+
+
Multicontaminada
+
+
+
+
Pura
+
-
+
+
Baços de animais não
Multicontaminada
-
-
-
-
infectados
Sem Crescimento
Não realizado
-
-
-
Amostras conservadas no
meio Cary-Blair
Baços analisados a fresco
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