Métodos Celulares Prof.Doutor José Cabeda Imunologia Células Sanguíneas Prof.Doutor José Cabeda Imunologia CD4 Células do S.I. T Linfócitos CD8 B NK Macrofagos Monócitos Neutrófilos PMN Outras células do Sangue plaquetas Eosinófilos Basófilos Prof. Doutor José Cabeda eritrócitos Imunologia Purificação de células do sistema Imunológico Prof.Doutor José Cabeda Imunologia Cell Separation Technologies Centrifugation : Density Filtration : Size Flow Cytometry (FACS) Size Granularity Fluorescence Batch affinity systems : antibody, avidin-biotin Batch magnetic systems Paramagnetic difference Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Separação em gradiente de densidade Numa centrifugação sedimentam primeiro as partículas mais densas, que por sua vez impedem as menos densas de sedimentar Ficol: polisacarideo Agrega eritrócitos tornando-os mais densos Metrizamida (composto denso contendo iodo) Densidade ajustável em função da concentração Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Separação em Gradiente descontínuo de densidade Soro plaquetas PBMC Ficoll-hypaque density Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Separação em gradiente contínuo de densidade (II) Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Separação Imunomagnética Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Immunomagnetic Labeling of Cells Target antigen Antibody (IgG) PBL FITC Magnetic bead HER-2/neu One-Step Labeling Two-Step Labeling Cell Cell Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Paramagnetic particles Large size 1 to 5 um in diameter Magnetic susceptibility of a cell: High Small number of beads per cell 1- 10 beads/cell Commercially available Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Paramagnetic colloidal beads Colloidal size 50 to 200 nm Spread in solution (Brownian Motion) Magnetic susceptibility of a cell: Low Large number of beads per cell 100 - 100,000 beads/cell Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Molecular Magnetic Labeling Erbium ion (Er3+) Paramagnetic ion High atomic magnetic dipole moment Ionic binding to the cell surface Ferritin Paramagnetic protein Hollow protein shell (13 nm) Deposition of Fe2O3 in the cavity (7 nm) Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Magnetic Labeling Paramagnetic particle Size Cell's magnetic susceptibility Labeling method Number per cell Commercially available Paramagnetic Molecular colloidal beads magnetic labels 1 – 5 µm 50-200 nm < 15 nm High Medium Low Ionic Immunological Immunological 1 - 10 100 - 100,000 > 100,000 ? Yes Yes No Prof. Doutor José Cabeda Immunological Imunologia Fraction (-) Fraction (-) Cell Separation Based on Antigen Expression Level Antigen Expression Level Antigen Expression Level Prof. Doutor José Cabeda Imunologia MACS® Cell separation system Plunger Magnet Separation column Remove the magnet magnetic cell non-magnetic cell Unlabeled cells Immunomagnetically labeled cells Prof. Doutor José Cabeda Imunologia ® HG4100 Incubation Cell Separation system Aspiration Resuspension magnetic cell non-magnetic cell Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Quadrupole Magnetic Flow Sorter (QMS) Prof. Doutor José Cabeda Imunologia High Gradient Magnetic Separator (HGMS) Separator Operation MACS Semi-flowthrough Holding Iron spheres material or wires Cell accumulation Yes Applicable Narrow cell size (small cells) Flow control No HG4100 QMS Batch Flow-through Test tube wall N/A Yes No Middle Wide N/A Yes Prof. Doutor José Cabeda Imunologia a' + - - b' Fm a - Prof. Doutor José Cabeda b + + + - MAGNET - - Axial Symmetry - - + + Cell Separation by the QMS + Imunologia Lymphocyte cell separation by the QMS CD8+ cells CD4+ cells Feed 26% 38% 38% a b 6% Feed a 96% b 6% 12% Prof. Doutor José Cabeda 99% Imunologia CD34 cell isolation by the QMS Feed a 0.02% 0.67% b 88.5% Total cell load = 2 x108 cells; CD34 cell recovery = 81%; Throughput = 1.75 x 105 cells/s Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Colony Formation from CD34+ Cells CD34+ cells CFU-GM BFU-E Prof. Doutor José Cabeda CFU-Mix (immature) Imunologia PANNING Aderência celular a uma superfície sólida Monócitos e macrófagos são naturalmente aderentes Outras células podem aderir se a superfície estiver conjugada com anticorpos apropriados Panning directo Panning indirecto Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Purificação positiva e negativa Purificação Positiva Panning Imuno-separação magnética Centrifugação gradiente densidade Centrifugal elutriation Formação de rosetas Citometria de Fluxo Purificação Negativa Todos os anteriores Citotoxicidade mediada por Anticorpo/complemento Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Rosetas Nos anos 70 Linfócitos T formam rosetas com SRBC Melhor rendimento se: • SRBC tratados c/ neuraminidase • SRBC tratados c/ AET (2-aminoethylisothiouronium bromide) Método barato mas pouco prático e de baixo rendimento Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Método de lise mediada pelo complemento Selecção negativa de células Passos: Marcação das células a eliminar c/ anticorpos Indução da lise celular c/ complemento de coelho Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Selecção negativa c/ L-LME L-Leucine methyl Ester (L-LME) é metabolizado nos lisosomas originando um metabolito tóxico Colocando as células em contacto c/ L-LME, os monócitos e NK são destruídos Separar as células mortas com lymphoprep Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Isolamento de linfócitos de orgãos linfóides secundários As células estão fracamente agregadas São separáveis por acção mecânica Forçar o tecido a passar repetidamente por uma malha de aço fino Utilizar a suspensão celular obtida, depois de purificada por lymphoprep Descartar os restos de tecido Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Análise de Células Prof.Doutor José Cabeda Imunologia Estudo de populações celulares por Citometria de fluxo Utilização de CD14/CD45 para definir a população de linfócitos Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Efeito de um “gating” correcto Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Estudo de activação linfocitária (I) Método de Activação Antigénio especifico pouco útil para culturas de linfócitos humanos Requer activação in vitro para enriquecimento prévio Mitogénio Concanavalina A (ConA) Phytohemaglutinina (PHA) Proteina A de staphylococcus Pokweed mitogen Anticorpos / Interleuquinas Células T • aCD3 • aCD2 • aCD28 • aTCR Células B • aIgM • aCD20 Prof. Doutor José Cabeda T+B •Ionoforo A23187 •Ionomicina •Ester de forbol •IL-2 •IL-4 Imunologia Estudo de activação linfocitária (II) Radioactividade 3 H-dTTP (Incorpora-se no DNA em cada divisão) Bromo desoxi-uridina (BrdU) Incorpora-se no DNA em cada divisão É Fluorescente Detectável por Citometria de fluxo Medida da [Ca2+] intracelular O Ca é um dos primeiros mensageiros secundários da activação celular Prof. Doutor José Cabeda Imunologia Medida da actividade citotoxica Incubação das células alvo (linhas tumorais) com 51Cr Se o estudo for de ADCC (antibody dependent cell mediated citotoxicity) as células alvo devem estar sensitizadas com anticorpo Incubação das células alvo com as NK/LAK Medida da radioactividade libertada no sobrenadante da cultura a b %lise x100% c b a=lise experimental cpm (efector + alvo) b=lise espontânea cpm (meio+alvo) c=lise máxima (SDS+alvo) Prof. Doutor José Cabeda Imunologia
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