Técnicas de Imunologia Citometria de Fluxo Slides adaptados de uma colecção amavelmente cedida por Alexandre Salvador (BioAtlântico) Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia O que é um Citometro de Fluxo? Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia O que é um Citómetro de Fluxo? É um aparelho que permite analisar vários parâmetros (celulares?) Capta e digitaliza a dispersão de fotões, provocada pela passagem de partículas em suspensão alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a um feixe de luz. Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Componentes Básicos de um Citómetro de Fluxo Fluídos • • Suspensão de partículas Fluxo laminar Óptica • • • Fonte de iluminação Captação da dispersão da luz e da fluorescência Filtração da dispersão e da fluorescência Electrónica • • Conversão do sinal em valores analógico-digitais Aquisição, Processamento, Análise Armazenamento por computador Prof. Doutor José Cabeda e Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Exemplos do que podemos analisar por Citometria de Fluxo: Complexidade Antigénios celulares Tamanho Metabolismos Enzimas Receptores ADN Citoquinas Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Propriedades de FSC e SSC Laser Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Óptica - Canal de Dispersão Frontal ( tamanho- FS ) Laser Sensor de FS Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Óptica - Canal de Dispersão Lateral ( complexidade- SS ) Laser Sensor de FS Sensor SS 900 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Óptica - Dispersão da Fluorescência Laser Sensor de FS Detectores de Fluorescência (PMT1, PMT4 etc.) Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Óptica - Propriedade dos Filtros Filtro ou Espelho Dicróico Colocado a 45o Fonte de Luz Luz Transmitida Luz Reflectida Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia BD Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia O que pode então dizer um Citometro de fluxo de uma célula? Tamanho (FSC) Complexidade (SSC) Fluorescência relativa. (FL1, FL2, FL3, FL4,...) Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia O que é a Fluorescência? Laser Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Intensidade de Fluorescência Emitted Fluorescence Intensity Binding Sites FITC FITC FITC FITC FITC FITC Numero de eventos FITC FITC FITC FITC Intensidade de Fluorescência Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission) Fluorochrome Laser (nm) Emission (nm) FITC Cy3 R-PE (PE) 488 488 488 525 565 575 PE-Texas Red (PE-TR) 488 615 Pe-Cy5 (TC1) PerCP (BD2) PerCP/Cy5.5 (BD) 488 488 488 667 675 695 PE-Cy7 488 767 Texas Red 595 615 APC Cy5 633, 635 633, 635 660 667 APC-Cy7 633, 635 767 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Espectros de Emissão FITC 1000 PI RPE APC PerCP 800 600 400 200 0 400 450 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Laser Voltage Pulso electrónico Laser Voltage Time Laser Voltage Time Time Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Tipos de diagramas 1 parâmetro Histograma 2 parâmetros Dot Plot Contour plot Density plot Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia As Regiões ou Portas electrónicas Histograma Dot plot Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia TRANSFERENCIA DE ENERGIA POR RESSONÂNCIA Transferencia no radiativa de energía Fluorescencia Energía ES GS Molécula Donadora PE Molécula Receptora Texas Red/Cy5/Cy7 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia 1 LASER (488nm) 3 COLORES Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia 1 LASER (488nm) 4 COLORES Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia 1 LASER (488nm) 5 COLORES Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Cytomics™ FC500 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Cytomics™ FC500 OPTICA: 2 lasers colineares: 488 nm 633 nm Detectores: FS con dos ángulos de captura (1-8°, 1-19°) Side Scatter 5 PMT sensibles al rojo (de 185 a 900 nm) Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Cytomics™ FC500 OPTICA: 620SP 675BP FL1 500LP 525BP Side Scatter FL3 FL4 755LP 488DLP FL5 FL2 Detailed Filter Specs Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia COMPENSATION Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia PE ECD PC5 Intensity FITC 500 600 700 800 Wavelength nm Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia PE ECD PC5 Intensity FITC 500 600 700 800 FL1 525 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia PE ECD PC5 Intensity FITC 500 600 FL1 525 700 800 FL2 575 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia PE ECD PC5 Intensity FITC 500 600 FL1 525 FL2 575 700 800 FL3 620 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia PE ECD PC5 Intensity FITC 500 600 FL1 525 FL2 575 700 FL3 620 800 FL4 675 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia FITC 500 Nominal Measured Signal 600 700 FL1 100 FL2 12 FL3 1 FL4 <0.1 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia FITC PE ECD PC5 FITC+ FL1 PE+ FL2 ECD+ FL3 PC5+ FL4 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia FITC PE ECD PC5 Prof. Doutor José Cabeda FL1 ???? FL2 ???? FL3 ???? FL4 ???? Técnicas de Imunologia FITC PE ECD PC5 85.5% 0.7% 0.3% 0.2% FL1 10.5% 67.8% 8.4% 4.2% FL2 3.1% 25.0% 66.7% 2.3% FL3 0.9% 6.5% 24.6% 93.3% FL4 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia FITC PE ECD PC5 100% 1.1% 0.4% 0.2% FL1 12.3% 100% 12.7% 4.5% FL2 3.6% 36.8% 100% 2.4% FL3 1.0% 9.5% 36.9% 100% FL4 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia FL2 Uncompensated vs Compensated FL1 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia FL2 COMPENSATION IS INTENSITY DEPENDENT FL1 uncompensated partially compensated Prof. Doutor José Cabeda fully compensated Técnicas de Imunologia COMPENSATE INSTRUMENT USING STAINED CELLS 1. Adjust PMT voltages using unstained cells 2. Adjust compensation for each fluorochrome Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Download
