Avaliação do repertório TCR
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Técnicas de Imunologia
Escolha das regiões génicas a
estudar



Regiões V
 Limitado na variabilidade
 Passível de estudo por
citometria
CDR1 e CDR2
 Variabilidade limitada à
região V
CDR3
 O mais variável
 Contribuição de V,D e J
 Variabilidade
 Sequência
 Tamanho
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Purificar as células a estudar


CD4 / CD8
 Variabilidade de uma pode
obscurecer alterações na
outra
 Repertório muito diferente
Local em estudo
 Sangue periférico
 Tecidos infectado/tumor
 Nódulos linfáticos
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Selecção da Técnica
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Southern
Blot
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Multiplex PCR for CDR3 length
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Electroforese Capilar (II)

Fluxo Electro-osmótico (FEO):
 A superfície do capilar de vidro-silica
 Tem grupos funcionais carregados negativamente,
 atrai iões carregados positivamente
 Estes iões migram para o pólo negativo, carregando
consigo moléculas do solvente.
 Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO
 Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO
 Moléculas negativas são mais lentas que o FEO
 todas as moléculas migram para o pólo negativo (com
velocidade que depende da sua carga e do seu peso
molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de
aparelhagem utilizado em HPLC.
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Electroforese capilar (III)
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Métodos baseados na
conformação


Conformação do dsDNA
 não depende da sequência
 A conformação de homodupletos é diferente da
dos heterodupletos
 A conformação dos heterodupletos depende da
sequencia de “mismatch”
Conformação do ssDNA
 depende da sequência (forma zonas de dupleto
intramolécular, dependentes da sequência)
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Single Strand Conformation
Polimorfism (SSCP)





dsDNA é desnaturado
dsDNA é diluido
Renaturação rápida
Corrida em condições semidesnaturantes e a temperaturas
fixas
Resultado depende muito de:
 Temperatura de corrida
 Concentração de
desnaturante
 Presença de certos
químicos (ex: glicerol, etc)
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WT1
mutantes
WT2
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Heteroduplex Analysis (HA)



Heterodupletos causam
 Distorção na conformação
 Migração no gel mais lenta
Heterodupletos podem existir por:
 Co-amplificação por PCR de heterozigotos
 Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR
Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e
WT+M
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Heteroduplex Analysis (HA)
Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp)
 Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou
DEM) aumenta a sensibilidade da HA
 A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente
semi-desnaturante que aumenta a resolução do
HA

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Citometria de Fluxo
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Análise de activação celular
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Medida da função precoce de receptores:
ensaio de activação CD69








CD2 “crosslinking”
 aCD2-biot + avidina
Colher sangue
Incubar c/ aCD2/2R-avidina
4h-37ºC
Lavar
Marcar c/
 CD4/CD69/CD3
 CD8/CD69/CD3
Lavar
Fixar
Analisar em citómetro
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Titular no tempo o efeito do
activador
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Medida da expressão de receptores
pós activação: ensaio quantitativo

Muitas moléculas variam de
expressão no decorrer da
activação
 CD95(fas)CD38,CD26,
CD25, receptores de
quimoquinas (CXCR4,
CCR3, CCR5)

Colher sangue
Marcar células
Correr no citómetro juntamente
com painel beads p/ calibração
da Intensidade de fluorescência


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Medida da activação celular:
concentração intracelular de Ca2+



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






Colher sangue
Separar cel.mononucleares
cultivar em meio de cultura c/
PHA 3 dias em 5%CO2
Cultivar 4 dias em meio c/ IL2
Adicionar INDO-1
Incubar 40 min-31ºC
Lavar
Incubar 5min-37ºC
Ler no citometro 30 seg.
Interromper p/ Activar
Ler no citometro
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Análise de Função celular
2 – Função das células fagociticas
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Definir a população de monócitos




FSC/SSC
SSC/CD14
SSC/CD16
HLA-DR pode também ajudar:
 Monocitos HLA-DR+
 Granulócitos HLA-DR-
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Definir a população de granulócitos


FSC/SSC
SSC/CD33
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Avaliação do aumento de expressão
de integrinas b2







Integrinas b2
 CD11a (LFA1) expresso em
todos os leucócitos
 CD11b,CD11c expressos em
monocitos, granulócitos e Nk
 Partilham a cadeia b (CD18)
 Mutações em CD18 originam
LAD1 (leucocyte adesion
deficiency type 1)
Estimular PBMC c/ PMA 15’-37ºC
Preparar 1 tubo sem estimulação
Marcar c/ CD11b
Preparar tb um control IgG2a
Fixar
Analisar em citómetro
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Estudo de expressão de FcReceptor




3 FcReceptors:
 CD16
 CD32
 CD64
CD64 aumenta rápidamente em monócitos e granulócitos em resposta
a IFN-g, GCSF (não GMCSF) e IL12
Marcação standard com a-CD64 utilizando beads standard para
intensidade de fluorescência para a quantificação
Útil para
 Confirmação de um processo inflamatório agudo
 Monitorizar e ajustar a dose em doentes a receber IFN-g
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Estudo de quimiotaxia

Estudo é possível, mas não é frequente no
laboratório de análises clinicas
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Estudo de fagocitose


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

Colher sangue em heparina (citrato e EDTA reduzem fagocitose)
Arrefecer o sangue em gelo-15min
Misturar c/ E.coli marcadas c/ FITC e opsinizadas c/Ig e complemento
(pool de soro)
Incubar 1 tubo a 37ºC e outro em gelo (control neg.)
Colocar em gelo
Adicionar sol quenching fria para impedir a fluorescência devida a
bactérias não internalizadas, mas ligadas à membrana no fagocito
Lavar
Adicionar sol.lise (lise de eritrócitos e fixação dos leucócitos)
Analisar em citómetro em 30 min.
Adicionalmente pode-se marcar as células c/ a-CD14 e a-CD33
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Estudo de “Killing”




A morte induzida pelos fagócitos é
primáriamente o resultado da
geração de radicais de oxigénio
activos (RO)
A principal via de geração de RO é
a via da NADPH oxidase
Deficiencias genéticas nestas
enzimas originam CGD (doença
granulomatose crónica).
Na presença de Peroxidases e
H2O2, PMN’s normais
convenientemente estimulados
oxidam o corante DHR-123 a
rodamina.123, tornando as células
fluorescentes. As células de
doentes com CGD não
metabolizam o corante.
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Análise de Função celular
3 – Apoptose
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



Colher sangue C/ anticoagulante
Manter o sangue sempre a RT
Processar de imediato e nunca
depois de 6h pós-colheita
Preparar PBMC
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Detecção de células c/ menor conteúdo
de DNA (subdiplóides)


Activação de endonucleases origina a degradação de DNA
PI (iodeto de propidium) é um fluorocromo com afinidade para DNA
 DNA fica fluorescente
 Intensidade de fluorescência é proporcional á quantidade de DNA/célula








lavar cels em HBSS
Ressuspender (106 cells) em ET-OH
Incubar 1 h a 4ºC
Remover sobrenadante (SN)
Adicionar HBSS,RNAse e PI
Incubar 15 min a RT
Manter a 4ºC no escuro
Ler no citómetro
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Detecção de células subdiplóides (Ex.)
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Detecção de células c/ quebras no
DNA (Método TUNEL)

Introdução de dUTP-FITC nas
quebras do DNA pela TdT

Incubar c/ permeafix 40’-RT
Lavar
Ressuspender na sol. Marcação
contendo TdT, tampão, dUTPFITC
Incubar 1h-37ºC
Lavar
Ler no citometro





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Método TUNEL (Ex.)
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Detecção de células c/ fosfatidilserina
translocada Método da anexina V



A fosfatidilserina encontra-se
habitualmente apenas no
folheto interno da membrana
Em células apoptóticas a
assimetria membranar perde-se
expondo fosfatidilserina
A Anexina V é capaz de se ligar
à fosfatidilserina
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Método da anexina V (Ex.)
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Estudos de citocinas
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Estudos de citocinas



Em condições normais não são detectáveis citoquinas nos
fluidos biológicos
A presença de citoquinas nos fluidos biológicos é
caracteristica
 de situações patológicas
 De estadios de situações patológicas
As citoquinas podem ser estudadas por:
 Imunoensaios (ELISA, RIA)
 Bioensaios
 Citometria
 Métodos moleculares
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Detecção de citoquinas: ELISA
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Bioensaios




Uso de uma linha celular que responde à presença de uma
citocina
Cultura da linha celular na presença e na ausência de fluido
a testar, e na presença da citocina recombinante.
A medida da actividade celular é indicadora da
presença/ausência de citocina
Tipos de bioensaios (actividade celular medida)
 Actividade citotoxica
 Proliferação
 Função celular específica
 Quantidade de uma proteína induzida
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Detecção de citoquinas:Bioensaios
Activation
of M in vitro
Test for effect
on other
cells
Cytokine secretion
Remove cytokine
containing
supernatant
+/Which cytokine?
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Especificidade dos bioensaios
Test for a characteristic
effect on other cells
e.g. interleukin-1
Induces proliferation in
thymocytes
Include an antibody
that blocks
interleukin-1
+
+ IL-1 absent
- IL-1 present
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Citometria de fluxo






Estimular as células
 Mitogénio
 Ag+coestimuladores
(a-CD28+ a-CD49d)
Bloquear a secreção de
citoquinas (brefeldin –BfA ou
monensin)
Lisar os eritrócitos e fixar
Permeabilizar as células
Marcar com anticorpo
Analisar
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Detecção de IFN-g por citometria
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Ensaios
Moleculares
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