Estudo de doenças Auto-imunes
Doenças Autoimunes endócrinas
Prof.Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Patologias autoimunes
sistémicas e de órgão
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LES
Lúpus discóide
Esclerodermia
Citopenias autoimunes
Síndrome de Goodpasture
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Cirrose Biliar Primária
Hepatite crónica activa
Síndrome Guillain-Barré
Uveite
Fibrose Pulmonar Idiopát.
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Artrite reumatóide
Artrite reumatóide juvenil
Sindrome de Sjögren
DMID (Diabetes )
Psoriase
Doença de Graves
Doença de Hashimoto
Esclerose Múltipla
Colite ulcerosa
Doença de Chron
Miastenia Gravis
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Doenças Autoimunes endócrinas
Tiroidite Crónica (Doença de Hashimoto)
 Doença de Graves
 Diabete Melitus dependente de Insulina
 Doença da Addison
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Auto-antigénios de
Doenças Autoimunes endócrinas
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Tiroidite crónica
 Tiroglobulina
 Peroxidase da Tiroide (TPO)
Doença de Addison
 Antigénios Adrenais
 Ovario, Testiculos, Placenta (uso em investigação)
Hipoparatiroidismo
 Antigénios da paratiróide (Ag citoplasmáticos)
Anemia Perniciosa
 Células parietais gástricas (subunidades a e b da ATPase H/K)
Doença de Graves
 TSH-R (Receptor da Hormona pituitária tirotropina )
 TSAb imita a acção da TSH
 TBAb bloqueia a acção da TSH (existe no hipotiroidismo)
 Testar a presença com células RFTL-5 ou substituto
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Diabetes Mellitus
Causada pela destruição das células beta do
pâncreas, mediada por células T
 Estudo da função celular T não é prática
 Presença de Autoanticorpos é marcador da
doença




Auto-anticorpos resultam da libertação de antigénios
das células beta, devido à sua destruição
Mediada pela presença de antigénio. Logo diminui com
a evolução da doença
Testados por ImunoFluorescência, RIA ou ELISA
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Auto-antigénios na IDDM
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Anti células beta = Islet cell antibodies (ICA)
 Existem em 70-80% dos doentes diagnosticados de
novo
 Descarboxylase do ácido glutâmico (GAD)
 Bandas de 64Kd e 50Kd
 Insulinoma Antigen (40 e 37Kd)
 IA-2
 IA-2b
 GLIMA – 38 Kd (só numa minoria de doentes)
Anti insulina (IAA)
 Existem em 50% dos doentes diagnosticados de novo
Quanto maior a variedade de auto-anticorpos, maior a
probabilidade de o doente possuir IDDM
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Auto-antigénios na IDDM
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Estudo de doenças Auto-imunes
Doenças Autoimunes do
Sistema Nervoso
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Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso

Bloqueio da transmissão colinérgica periférica por autoanticorpos
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Miastenia Gravis


Presença de anticorpos anti-receptor da acetilcolina na
membrana pós-sináptica do musculo
Lambert-Eaton Myastenic Syndrome (LES)

Presença de anticorpos anti canal de cálcio regulado
pela voltagem, que regula a libertação do transmissor
no terminal nervoso do músculo
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Técnicas de Imunologia
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Técnicas de Imunologia
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Técnicas de Imunologia
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Estudo de doenças Auto-imunes
Anemia Hemolitica Autoimune
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Técnicas de Imunologia
Anemias Hemoliticas autoimunes
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Técnicas de Imunologia
Anemias Hemoliticas autoimunes:
Técnicas diagnósticas laboratoriais

Direct Antiglobulin Test (DAT)
 Demonstra o “coating” dos RBC com Ab in vivo
 Usado para investigar :
 Anemia Hemolitica Autoimune (AIHA)
 Hemólise induzida por drogas
 Doença Hemolitica do recém-nascido
 Reacção aloimune á transfusão
 Em WAMA (worm) IgG liga RBC de modo estável
 Em CAD (cold) IgM liga RBC na circulação periférica, activando
o complemento (C3), libertando-se a IgM quando a circulação
atinge zonas mais quentes
 Em PCM (semelhante ao CAD mas com IgG
 sangue coag. Activ. complemento  falsos positivos
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Técnicas de Imunologia
DAT: procedimento
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Colher sangue em EDTA (previne activ.complemento)
Preparar RBC (2-4%) em PBS
1 gota RBC em 3 tubos (aIgG, aC3b/C3d, e albumina como controlo)
Lavar 4 vezes com PBS (spin 1 min, 3400rpm)
Adicionar 2 gotas de aIgG, aC3b/C3d, e 6% albumina
Misturar e spin o tubo com aIgG 15’’-3400rpm
Ressuspender suavemente e observar macroscópicamente e
microscópicamente para a presença de aglutinação
Incubar 5 min-RT os restantes tubos
Repetir 6 e 7 para os restantes tubos
Adicionar celulas indicadoras (RBC revestidas com o respectivo antigénio)
a cada tubo negativo
Repetir passos 6 e 7, descartar tubos com resultados negativos pós passo 10
Em Indivíduos recentemente transfundidos separar os eritrócitos
transfundidos (mais densos) por centrifugação. Se existir AIHA ambas as
populações apresentam DTA positivo. Se apenas 1 população for positiva
trata-se de Reacção transfusional tardia.
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Técnicas de Imunologia
Eluição de anticorpos de RBC
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Lavar RBC com PBS (remove proteínas não ligadas
especificamente)
Ressupender RBC em solução de glicina a baixo pH
(promove a dissociação dos anticorpos)
Centrifugar
Recolher o sobrenadante enriquecido em anticorpos
Neutralizar o sobrenadante com solução tamponada
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Técnicas de Imunologia
Determinação de amplitude térmica
de auto-anticorpos
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Cold reactive Ab reagem a 0-4ºC
Anticorpos patogénicos reagem a cerca de 30ºC
Colher e manter amostra a 37ºC
Spin 3400rpm-1min
Incubar 5’ a 37ºC
1 gota RBC 4% a 37ºC + 2 gotas soro/plasma a 37ºC
Agitar; incubar 1 hora a 37ºC
Spin 15’’-3400rpm e examinar macroscópicamente
Repetir 5 e 6 a 30ºC
Repetir 5 e 6 a 22ºC
Pos a 30 e 22ºC  Ig patológicas
Pos só a 22ºC Cold aglutinin
A reactividade pode ser melhorada adicionando 30% BSA
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Técnicas de Imunologia
Indirect Antiglobulin Test (IAT):
(Antibody screen for RBC-Ab)
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Routine pre-transfusion test
Soro incubado com 2 RBC grupo O comerciais e observados
para aglutinação em 2 fases:
 37ºC com agente “enhancer”*
 Após adição de a-IgG (reagente coombs)
Se pos. O soro é testado com um painel mais alargado de
RBC (8-10) para identificar a especificidade, e excluir os
falsos positivos devidos a alo-anticorpos
WAIHA geralmente pan-RBC
* BSA, Low Ionic strenght Saline (LISS), LISS com PEG ou polybrene, ou RBC tratados enzimaticamente)
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Estudo de Alergias
Quantificação de alergénios
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Estudo de Alergias
Estudos in-vivo
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Técnicas de Imunologia
Quantificação de Alergénios
Skin testing
 Protein content
 Quantificação de alergénios individuais
(RIA,ELISA, etc)
 Imunoelectroforese
 PAGE
 Imunobloting
 Inhibition immunoassays
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Técnicas de Imunologia
Skin testing
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Para controlar a possibilidade de choque séptico
 Médico disponível em SOS
 Garrote disponível em SOS
 1 mg epinefrina disponível em SOS
Seringa hipodérmica com 100 mL alergénio
 Injecção de 20-50 mL, cerca de 3mm diâmetro
 Observação aos 15 min
 Medir dois diâmetros e calcular média
 Nova observação aos 30 min
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Técnicas de Imunologia
Skin testing
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Técnicas de Imunologia
Estudo de Alergias
Testes Laboratoriais
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Técnicas de Imunologia
Testes laboratoriais para estudo
de alergias
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Determinação de IgE total
Determinação de IgE específica para um alergénio
Screening multialergénico
Imunoblotting com alergénios
Medida de alergénios caseiros
Skin testing
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Técnicas de Imunologia
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Técnicas de Imunologia
Determinação de IgE total
Captura com aIgE conjugada com suporte
sólido
 Lavar
 Reagir com aIgE marcada
 Lavar
 Detectar a marcação (radioactividade ou
actividade enzimática)

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Técnicas de Imunologia
Determinação de IgE específica
para um alergénio
Alergénio ligado a matriz sólida
 Adicionar soro doente
 Incubar e lavar
 Reagir com aIgE marcada
 Lavar
 Detectar a marcação (radioactividade ou
actividade enzimática)
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Técnicas de Imunologia
Multiple Alergen Screens


Conjugar multiplos alergénios a uma matriz sólida
Ex:
 Mistura de árvores
 Mistura de relvas
 Mistura de sementes
 Dermatofagoides farinae/pteromyssinus dust
mites
 Pelo de cão e gato
 Etc...
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Técnicas de Imunologia
Specific IgE Inhibition immunoassays
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
Reconstituir o alergénio inibitório em PBS em
diluições sucessivas
Usar PBS como 0% inibição
Adicionar inibidor em diferentes diluições ao soro
do doente e incubar 2 horas com agitação
Alergénio ligado a suporte sólido
Fazer um ensaio de detecção de IgE específica
Calcular a % inibição para cada diluição do
inibidor
Fazer um plot da inibição em função da
concentração de inibidor
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