Técnicas em Imunologia Parte I Métodos Laboratoriais em Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Técnicas baseadas em imunoglobulinas Ensaios Liquídos (ensaios homogéneos) Difração da luz Nefelometria turbidimetria Outros ensaios liquidos EMIT CEDIA Imunofluorescência Aglutinação Quimioluminescência Ensaios Sólidos (ensaios heterogéneos) ELISA Competitivo Não-competitivo indirecto RIA Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Técnicas baseadas na difracção da luz Imunoturbidimetria Nefelometria Baseada na reacção de imunoprecipitação Mede a quantidade de luz difractada devido à presença de complexos imunológicos O ângulo de difracção e o comprimento de onda são aspectos importantes 31º permite melhor razão sinal/ruído Baseada na reacção de imunoprecipitação Mede a diminuição de luz que consegue atravessar uma solução na presença de complexos imunológicos O detector está sempre alinhado com a fonte de luz (0º), pelo que a medida não é da luz difractada, mas da não difractada Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Curva de imunoprecipitação Assumindo: Ig pelo menos bivalentes IgG Antigénio com pelo menos 2 epitopes Se Ab em excesso, um aumento de Ag implica um aumento da reacção Se Antigénio em excesso, um aumento de antigénio diminui a probabilidade de um Ab ligar 2 antigénios, o que diminui a precipitação A quantificação só é possível se o anticorpo estiver em excesso Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Cinética da Curva de imunoprecipitação A reacção inicia-se imediatamente, sendo visivel 20s após a adição do antigénio A reacção prossegue de modo aproximadamente linear até que a precipitação dos complexos origina uma aparente diminuição da reacção Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Rate Nephelometry [Ab] é constante Aumento progressivo da [antigénio] Deve ser realizada na zona de excesso de Ab Em nefelómetros automáticos deste tipo, 2 [antig] são inicialmente ensaiadas. Dependendo do resultado: São testadas novas [] É testada o excesso de antig Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia End-point nephelometers Medida no ponto máximo da reacção Medida de branco ou no inicio da reacção Valor interpolado de uma curva de calibração Variações Particle enhanced Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Particle enhanced nephelometry São utilizadas particulas de latex conjugadas com anticorpo ou antigénio competidor Aumento de sensibilidade Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Ensaios Requisitos Qualquer fluido Soro Plasma Urina CSF Deve ser diluído (para não interferir na leitura) Amostras ricas em lipídios devem ser clarificadas por filtração ou ultracentrifugação Amostras ictéricas ou hemolisadas Não afectam a nefelometria Afectam a turbidimetria Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Outro ensaios homogéneos CEDIA (Cloned enzyme donor assay) B-galactosidade em 2 fragmentos inactivos enzyme donnor Enzyme acceptor A reacção imune junta-os activando a enzima. Se não houver antigénio o anticorpo liga-se à enzima inactivando-a EMIT (Enzyme multiplied immunoassay technique) Aumento ou diminuição da actividade enzimatica com a reacção Ag-Ab Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Imunofluorescência Anticorpos conjugados com compostos fluorescentes Conjugado utilizado como revelador directo Aumento de 10 a 1000 vezes na sensibilidade Grande aumento na rapidez de detecção Vantagens relativamente à RIA: Tão sensivel Reagentes mais estáveis Mais fácil de implementar Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Principais fluorocromos utilizados Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Técnicas de imunofluorescência (I) Directas Anticorpo directamente conjugado Indirectas Anticorpo secundário conjugado Acopladas Duas reacções acopladas Fluorescence polarization immunoassay Baseia-se no aumento na polarização da luz emitida quando um antigénio-FITC forma complexos imunes, o que se deve às restrições ao movimento rotacional do antigénio no complexo Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Técnicas de imunofluorescência (II) Fluorescent Quenching assay Método competitivo directo que utiliza [ab] fixa Competição para o ab entre o antigénio marcado e o não marcado (a testar) A fluorescência é absorvida (quenched) quando o antigénio marcado se liga ao anticorpo A intensidade de fluorescência é uma medida da quantidade de antigénio não marcado que competiu para o anticorpo Método indirecto Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Técnicas de imunofluorescência (III) Substrate labelled Fluorescent immunoassay Método indirecto Analito ligado a um modulador que influencia o sinal gerado Actividade do modulador influenciada pela ligação do Ab Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Técnicas de imunofluorescência (IV) Fluorescent energy transfer immunoassay Método competitivo Analito conjugado com FITC Anticorpo ligado a Rodamina Se o analito conjugado ligar ao anticorpo, por ressonância a energia do FITC excita a rodamina Se por competição, o analito impedir o anticorpo de se ligar ao conjugado, não haverá excitação da rodamina Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Problemas da imunofluorescência Autofluorescencia Proteinas do soro (320350nm) Bilirubina (430-470nm) Urina apresenta elevada linha de base Para obviar a estes problemas pode-se Tratar a amostra com Enzimas proteoliticas Agentes oxidantes Agentes desnaturantes Quenching Bilirrubina Hemoglobina Fotodestruição Diminuição da fluorescência ao longo da excitação Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Aglutinação Baseada na reacção ag-ab Observada visualmente Tipos: Directa (ABO) IgM aglutina várias RBC IgG necessita de reagente de Coombs (anti-human-ab) para fazer a ponte Indirecta ou passiva Antigénio ligado a subtância inerte Reversa Anticorpo ligado a substância inerte Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Aglutinação de partículas Mais sensiveis que a aglutinação Mensurável por nefelometria, turbidimetria, contagem de particulas Anticorpo ou antigéneo conjugado com particulas de látex Reacção ag-ab aglutina as particulas que saem de solução A medida das partículas em solução é inversamente proporcional ao titulo a determinar Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Ensaio quimioluminescente Produção de luz por uma reacção quimica, habitualmente uma reacção de oxidação-redução O modo mais sensível de detecção em imunoensaios (atomole=10-18 a zeptomole=10-21) Compostos utilizados: Esteres de acridina (detecção do NaOH e H2O2) Limite de detecção de 0.5 atomoles Derivados do isoluminol (detecção com H2O2 e um catalizador) Limite de detecção de 50 atomoles Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Enzimas utilizadas em ensaios Quimioluminescentes Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Ensaios em fase sólida ELISA Competitivo Não competitivo-indirecto Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Ensaios em fase sólida ELISA Sandwich ou de captura Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Resolver problemas do ELISA Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Electroforese de Imunoglobulinas Electroforese em agarose de alta resolução Imunofixação Imunosubtracção Electroforese capilar Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Electroforese de Ig em agarose Electroforese + Corar com Ponceau S e secar Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Imunofixação Electroforese Aplicação de tira de acetato de celulose com anticorpo monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um precipitado onde houver Ig correspondente Proteinas não pp são lavadas Corar os pp com amido black nigrosin Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Imunosubtracção Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Crioglobulinas (I) Tipo I Monoclonal (IgG, IgM, IgA, raramente c.leves) Tipo II Mistas (2 ou mais Ig, sendo uma monoclonal) Tipo III Policlonal Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Crioglobulinas (II) Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
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