Universidade Federal do Rio de Janeiro
Bioquímica
Enzimas
2º período - Enfermagem
Éverton Dias D’Andréa
1
Setembro 2011
Nutes: Núcleo de Tecnologia Educacional para a Saúde é um órgão suplementar do Centro de Ciências da Saúde da UFRJ
que articula ações de formação de recursos humanos, pesquisa e desenvolvimento na área da Educação em Ciências e Saúde.
Bioquímica Enfermagem
Introdução a Enzimologia
 Introdução
A manutenção da vida depende:
• da auto-replicação dos organismos vivos;
• da realização de reações químicas, sendo que estas reações químicas
devem atender duas exigências fundamentais:
- precisam ser altamente específicas de modo a gerar produtos definidos
- devem ocorrer a velocidades adequadas à fisiologia da célula
A insuficiência na produção ou na remoção de metabólitos pode levar a
condições patológicas.
alto grau de especificidade por seu substrato
aceleram reações químicas
ENZIMAS
funcionam em soluções aquosas
a maioria funcionam em pH e temperatura
fisiológicas
• As enzimas aceleram a velocidade de uma reação química sem serem
consumidas no processo.
• Como suas concentrações permanecem constantes eles são eficientes em
pequenas quantidades.
Enzima
Substrato
Produto
Enzima
+
+
Energia de ativação sem enzima
Diferença entre
a energia livre
de S e P
S
Energia de ativação com enzima
P
Caminho da Reação
• Enzimas são catalisadores que aumentam a velocidade da reação de 5 à
17 ordens de grandeza.
Anidrase
carbônica
 Estrutura das enzimas
• Todas as enzimas são proteínas, como tal sua função depende da sua
estrutura.
• A estrutura da enzima dependerá da sequência primária; secundária;
terciária e quartenária.
 Estrutura Primária
Formada pela sequência de aminoácidos unidos pela ligação peptídica.
 Estrutura Secundária
Se refere a arranjos particularmente estáveis entre os aminoácidos, gerando
estruturas regulares recorrentes.
 Estrutura Terciária
Descreve todos os aspectos do enovelamento tridimensional de uma
proteína.
 Estrutura Quartenária
Ocorre quando uma proteína possui duas ou mais subunidades
polipeptídicas.
 Muitas enzimas são proteínas (podem variar de 12.000 a 1 milhão de Da):
 algumas requerem um co-fator (íons inorgânicos ou uma co-enzima);
 grupo prostético: coenzima ou
covalentemente à proteína enzimática;
íon
metálico
ligado
muito
forte
ou
 holoenzima: enzima cataliticamente ativa completa, juntamente com sua
coenzima e/ou íon metálico ligado;
 apoenzima ou apoproteína – parte protéica de uma enzima sem quaisquer cofatores ou grupos prostéticos;
 sítio ativo – região que forma a maquinaria para a reação química de catálise, é
constituída por grupo de aminoácidos.
Classes de enzimas
• Especificidade da enzima pelo substrato
Sítio catalítico – microambiente específico
• 40% forma similar;
• enovelação: folhas beta pregueadas
anti-paralelas + α-helice pequenas.
Hidrólise
enzimática
aminoaa
teminal
aa aa aa aa aa
elastase
tripsina
aa apolares:
Gly, Ala,Val
aa positivos:
Arg, Lys
quimiotripsina
aa aromáticos:
Phe, Tyr, Trp
carboxiteminal
 Modelos para explicar a formação do complexo Enzima-Substrato
 Modelo chave e fechadura – o sítio catalítico é rígido e complementar
à forma e ao tamanho do substrato.
 Modelo encaixe induzido – o sítio catalítico não está totalmente pré-formado, a
enzima se ajustaria ao substrato.
 Catálise Ácido-Base – que ocorre com a participação de aminoácidos com
cadeias laterais ionizáveis, capazes de doar ou liberar prótons durante a
catálise para estabilizar os intermediários (H+, OH-).
 Catálise Covalente – resulta do ataque nucleofílico ou eletrofílico de um
radical do sítio catalítico sobre o substrato, ligando-o covalentemente à
enzima e induzindo a sua transformação em produto.
Mecanismo da quimiotripsina
 Catálise por íons metálicos – metais firmemente ligados ao sítio catalítico
interage entre a enzima e o substrato estabilizando o estado de transição.
Co-fator – molécula inorgânica pequena que uma apoenzima requer para a
sua atividade.
 Coenzimas – funcionam como aceptores de átomos ou de grupos funcionais.
Durante a reação a coenzima e o substrato são alojados no sítio catalítico da
enzima. O fato de as coenzimas estarem se renovando constantemente permite
que sua concentração celular seja menor do que as concentrações do substrato.
 Classificação das enzimas
As enzimas são classificadas de acordo com o tipo de reação que catalisam.
• Oxido-redutases – enzimas que catalisam reações de óxido-redução,
transferência de elétrons.
lactato
desidrogenase
lactato
piruvato
• Transferases – catalisam a transferência de um grupamento de uma molécula a
outra.
alanina
aminotransferase
alanina
α-cetoglutarato
piruvato
L-glutamato
• Hidrolases – catalisam a reação de hidrólise de uma única ou várias
ligações covalentes por introdução de uma molécula de água.
peptidase
• Liases – catalisam reações de dupla ligação adicionando ou removendo
grupamentos.
piruvato
carboxilase
piruvato
acetaldeído
• Isomerases – catalisam reações transferindo grupos dentro da mesma
molécula formando isômeros.
Fosfoglicose isomerase
• Ligases – catalisam reações formando ligações do tipo C-C, C-S, C-O e
C-N acopladas à quebra de ATP.
acetil CoA
carboxilase
Acetil-CoA
 Reações enzimáticas com mais de um substrato
Sequencial (formação do complexo ternário)
Creatina cinase
Lactato desidrogenase
Pingue-pongue ou duplo deslocamento
Aspartato aminotransferase
 Fatores que afetam a velocidade enzimática
 Temperatura
 pH
Cada enzima tem
seu pH ótimo
[produto]
 Influência da concentração de enzima e substrato
5[S]
4[S]
3[S]
2[S]
[S]
Velocidade
da reação
tempo
[E]
 Introdução à Cinética Enzimática
• Estudo da velocidade da reação
Pode ser medido por:
- Quantidade de produto formado
ou
- Quantidade de substrato transformado
(sempre na unidade de tempo)
Velocidade
da reação
[produto]
Atividade enzimática pode ser medida pela velocidade da
reação catalisada
tempo
[S]
 Cinética enzimática
Representação de uma reação enzimática em 2 etapas
E + S
k1
k-1
ES
k2
P
Após curto tempo - estabilidade dinâmica com relação a [E] e
[ES] é alcançado
Para uma determinada [S]
inicial, haverá um intervalo de
tempo em que a velocidade da
reação
será
relativamente
constante, chamada de Vinicial,
V0 ou simplesmente V da reação
Vo = K2 [ES]
[Et]=[E] + [ES]
V de Formação de ES = K1 [E] [S]
V de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES]
Já que Formação de [ES] = Degradação de [ES]
K1 ([Et]-[ES]) [S] = K –1[ES] + K2 [ES]
K1[S][Et] - K1[S][ES] = (K –1+ K2) [ES]
[ES] =
[Et] [S]
[S] + (K –1+ K2) / k1)
Km
[ES] = [Et] [S]
Km
Se, V0 = k2 [ES]
+ [S]
Então: V0 = k2 [Et] [S]
Km +[S]
Em V máxima
[Et] = [ES]
Então V max = k2 [Et]
Sendo assim
Vo = Vmax [S]
Km +[S]
Equação de Michaelis-Menten
Uma propriedade importante:
Quando V = Vm
2
Km =
2 . [S] - [S]
Vm =
2
Vm . [S]
Km +[S] =
2 . [S]
Km +[S]
Km= [S]
Propriedades importantes de Km:
• É numericamente igual a [S] na
qual a velocidade da reação é
metade da Vmax.
• Característico de cada enzima.
• Reflete a afinidade da enzima pelo
seu substrato.
Km = [S]
 Gráfico Linewevear-Burk
1
v

Km
Vmax [S]

1
Vmax
1
v
1
Vmax
-1
Km
1
[S]
 Consequências importantes de Km
Km
Km
Afinidade da enzima pelo substrato
Afinidade da enzima pelo substrato
v
1/V
Vmáx
V/2
Km Km
[S]
-1/Km -1/Km
1/s
 Inibição enzimática
Inibidores de enzimas são moléculas que interferem com a catálise diminuindo
ou interrompendo as reações enzimáticas. Quanto ao tipo de inibição:
• inibição inespecífica: diminuição da atividade de todas as enzimas por
temperatura, pH ou agentes desnaturantes (ex. uréia).
• inibição específica: agente inibidor diminui a atividade de uma enzima
específica ou de um grupo restrito de enzimas. A inibição pode ser irreversível ou
reversível.
 Inibidor Competitivo
Inibidor análogo não metabolizável do substrato compete com o mesmo pelo sítio
catalítico da enzima livre.
Km é modificado, mas Vmáx não é alterada.
É necessário de [S] maior para deslocar o
inibidor.
 Intoxicação por metanol
metanol
metanol
metanol
Álcool
desidrogenase
formaldeído
formaldeído
formaldeído
cegueira
Álcool
etanol etanol
desidrogenase
etanol metanol
etanol metanol
etanol
etanol etanol
acetaldeído
acetaldeído
acetaldeído
acetaldeído
1- sem inibidor
2- com inibidor [ I ]
3- com inibidor 2[ I ]
 Inibidor Não-Competitivo
Inibidor se liga numa região deferente do sítio catalítico da enzima.
Vmáx diminui, mas o Km não é alterado.
[S] maior não diminui a inibição.
1- sem inibidor
2- com inibidor [ I ]
3- com inibidor 2[ I ]
 Inibidor Incompetitivo
O inibidor se liga somente no complexo ES em sítio próprio.
Inibidor não possui semelhança estrutural
com o substrato.
Km e Vmáx da enzima diminuem.
1- sem inibidor
2- com inibidor [ I ]
3- com inibidor 2[ I ]
Exemplos de inibidores farmacológico
• 3'-azido-2',3'-didesoxitimidina (AZT)
• nevirapina
• sulfonamidas
 Inibidores Competitivos de proteases do vírus HIV
Gag e Gag Pol são clivados pela protease do vírus HIV em 9 pontos
específicos para produzir proteínas funcionais. O precursor Gag vai originar
proteínas estruturais e o precursor Pol vai originar enzimas como transcriptase
reversa, integrase e proteases.
Amprenavir
 Inibidor Irreversível
O inibidor se liga covalentemente a um grupo funcional da enzima
formando um complexo estável.
Ácido acetil salicílico
Sítio Ativo da Ciclooxigenase
•Inibidor irreversível
Ligação covalente
Ácido acetil salicílico
•Inibidor competitivo e reversível
Interações sem ligação covalente
Ácido mefenâmico
 Regulação da atividade enzimática das enzimas alostéricas
Funcionam através da ligação não-covalente e reversível de um metabólito
regulador (modulador)
São maiores e mais complexas, possuem duas ou mais cadeias
polipeptídicas.
Não obedecem a cinética de Michaelis-Menten.
Tipos de enzimas alostéricas: homotrópica (modulador é idêntico ao
substrato); heterotrópica (modulador é diferente do substrato)
Um modulador alostérico pode ser tanto um inibidor quanto um ativador.
Aspartato Transcarbamilase (ATCase) – síntese de pirimidinas
Fosfofrutokinase 1 (PFK-1)
 Regulação da atividade enzimática
modificação covalente reversível
Fosforilação – Regula inúmeros processos
metabólicos ativando enzimas chaves das
vias metabólicas.
por
 Feedback negativo
Coordena o fluxo de enzimas por uma via metabólica.
A
B
C
D
E
 Ativação proteolítica
 Aplicações das enzimas
Setor industrial – permitem usarem processos mais econômicos, diminuindo
consumo de energia e recursos, mais confiáveis que poluem menos.
Saúde – são usadas para detectar algum tipo de doença, ou dano tecidual, ou
como marcador de exames. Algumas doenças são causadas pela falta de
enzimas (ex. fenilcetonúria; intolerância a lactose).
 Infarto do miocárdio