Aula de enzimologia
Tema
Imobilização de enzimas
Prof. Adriane M. F. Milagres
Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena
Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
Sumário
1. Introdução
2. Métodos de imobilização
3. Suportes para a imobilização de enzimas
4. Efeitos da imobilização de enzimas
5. Exemplo de imobilização
Definição:
• Entende-se por enzima imobilizada, aquela física ou
quimicamente associada a um suporte ou matriz ,
usualmente sólida, insolúvel em água e inerte, que
não seja essencial a sua atividade.
Objetivos da imobilização :
•
•
•
1- Reutilizar a enzima (enzimas são caras)
2- Aumento da estabilidade
3 – Remover a enzima que permanece contaminando o produto (custo
extra de purificação)
Histórico do uso de enzimas
imobilizadas
1- Em 1916, ocorreu a primeira utilização de enzima imobilizada
(invertase em carvão vegetal).
2- Em 1969, os processos com enzimas imobilizadas também têm
utilização industrial em larga escala usando L- aminoacilase
imobilizada
em
DEAE–Sephadex
para
produção
Laminoácidos.
•
Quase simultaneamente foi colocado em operação ao
mesmo tempo o processo de produção de xaropes de frutose a
partir de amido de milho usando glicose isomerase
imobilizada.
3- Maior uso de enzimas imobilizadas é na produção de xaropes
de frutose através da glicose-isomerase imobilizada é realizada
em grande escala nos Estados Unidos
Vantagens e desvantagens do uso de
enzimas imobilizadas
VANTAGENS
•
•
•
•
•
Desenvolvimento de sistemas contínuos
Maior estabilidade enzimática
Uso mais eficiente do catalisador através de reutilizações
Efluentes livres de catalisadores
Maior versatilidade na etapa de separação
DESVANTAGENS
1) Custo adicional do suporte, reagentes e da operação de imobilização
2) Perdas de atividade durante a imobilização
3) Técnica pouco adequada a substratos insolúveis ou de alta massa molar
4) Maiores riscos de contaminação na operação contínua de reatores
5) Restrições difusionais e impedimento estérico
Escolha dos métodos e suportes para
imobilização
• Dependerá das características das enzimas e
das condições de uso da enzima imobilizada;
• O binômio suporte-método mais adequado será
aquele que propiciar uma maior atividade após
imobilização
Suportes para Imobilização
•
Enzima
Suporte
Propriedades
bioquimicas
Caracteristicas
quimicas
Propriedades
mecanicas
Tipo de reação e cinética
Metodos
imobilização
Efeitos de transferencia
de massa
Estabilidade
operacional
Desempenho
- rendimento
- capacidade de carga
RI= EI x 100
ET
CC = EI
W
Suportes para imobilização de enzimas
1.
2.
3.
4.
Inerte.
Fisicamente forte e estável.
Baixo custo.
Melhor se puder ser regenerada após o uso e meia-vida
da enzima.
5. Superfície disponível para a enzima.
Adsorção de enzimas em suportes insolúveis
1) Misturar a enzima com o adsorvente (em condições
apropriadas de pH e força ionica)
2) Incubar
3) Lavar a enzima que não ficou ligada ou que ficou
fracamente ligada
Critérios para avaliação de um
sistema enzima-suporte
•Estabilidade de fixação - a enzima deve estar bem fixa ao
suporte.
•Estabilidade enzimática - a enzima não deve sofrer
modificações como desnaturação.
•Resistência mecânica - o suporte deve resistir a várias
condições desfavoráveis como, o peso do suporte dentro do
reator.
•Capacidade de carga - o suporte deve fixar um número
elevado de unidades enzimáticas por unidade de área - um
pequeno reator uma grande capacidade catalítica.
Tipos de suportes
silica
Alumina
vidro
Fibra de casca de coco
Ligação covalente em suporte
• A ligação covalente se dá pela reação de grupos reativos
do suporte, ativado ou não, com os grupos funcionais da
enzima
• ligação de grupos - NH2, -COOH, -OH, -SH, entre outros,
Ligação cruzada
Imobilização de enzimas em glutaraldeído
Imobilização de enzimas em celulose
Imobilização de enzimas em matriz com grupo carboxílico
Algumas observações....
1) Lisina é o aminoácido mais apropriado
covalentemente ao suporte devido
reatividade, especialmente em soluções
também é pouco presente e envolvida
das enzimas.
para se ligar
a sua alta
alcalinas. Ela
no sitio ativo
2) A imobilização de uma enzima na presença de
excesso de substrato ou de um inibidor competitivo
impede que a imobilização ocorra pelo sítio ativo.
Efeitos causados pela imobilização
• Retenção da Atividade Enzimática
1)
algumas moléculas enzimáticas podem estar imobilizadas em
uma configuração que impede completamente o acesso do
substrato ao centro ativo;
2) o grupo reativo do centro ativo pode estar envolvido a ligação
ao suporte
3) moléculas da enzima podem ter se ligado em uma configuração
que as torne inativas;
4) as condições de reação no processo de imobilização podem
causar desnaturação ou inativação.
Parâmetros cinéticos para a invertase livre e imobilizada
Parâmetro
Invertase livre
Invertase imobilizada
KM
26 mM
Vmax
1,1 U
8,1 mM (alginato de cálcio)
52,2 (quitina)
32,2 (polietileno ativado)
0,25 (alginato de cálcio)
0,74 (quitina)
0,32 (polietileno ativado)
(Vitolo, 2001)
Efeitos difusionais
• Quando a enzima é imobilizada, o substrato tem que
difundir na solução através de um filme líquido
estacionário presente nas superfícies do suporte e, se
este é poroso, através dos poros até alcançar o sitio
ativo das enzimas - pode restringir a taxa de reação
• velocidade de difusão do substrato < velocidade de
transformação pela enzima - Vmáx mais baixa -não se
atinge a saturação.
• efetividade (f) = (v’) / (v), f é função de [S]
Resistência difusional
• Efeitos difusionais Externos
Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser
transportado do seio da solução até a superfície de
catalise,devendo, por conseguinte atravessar uma camada
líquida, assim o consumo de substrato através da membrana
líquida pode ser imaginado como resultado de um gradiente.
• Os efeitos de difusão externa afetarão o transporte de massa e
podem ser minimizados tanto pelo aumento da agitação, caso
de reatores continuamente agitados (CSTR), quanto pelo
aumento do fluxo de substrato, caso do reator pistonado (PFR).
• Efeitos Difusionais Internos
Surgem devido à movimentação do substrato no interior do meio
catalítico. - difusão e reação ocorre simultaneamente
• Efeitos Microambientais
A enzima ao ser imobilizada passa a ser circundada por um
ambiente diferente do que quando estava livre, especialmente se a
matriz ou suporte possui carga.
Os efeitos de circunvizinhança, que dependem da natureza física e
química do suporte, podem acarretar uma distribuição desigual do
substrato, produtos e cofatores entre a região vizinha ao sistema
imobilizado e o resto da solução.
• Efeitos Acessibilidade
resultado de impedimento físico, formado pelo suporte, ao acesso
de moléculas grandes ao centro ativo da enzima.
• Efeitos na Estabilidade
enzimas durante a imobilização apresentem mudanças na
estabilidade térmica.
Alguns usos industriais das enzimas imobilizadas
Enzima
EC number
Produto
Aminoacilase
3.5.1.14
L-Aminoacidos
Aspartato amonia-liase
4.3.1.1
L-Aspartico
Aspartato 4-decarboxilase
4.1.1.12
L-Alanina
Glucoamilase
3.2.1.3
D-Glucose
Glucose isomerase
5.3.1.5
Xarope de frutose
Hidantoinasea
3.5.2.2
D- e L-amino acidos
Invertase
3.2.1.26
Açúcar invertido
Lactase
3.2.1.23
leite e soro
Lipase
3.1.1.3
Cocoa butter substitutes
Nitrile hidratase
4.2.I.x
Acrilamida
Penicilina amidases
3.5.1.11
Penicilinas
Rafinase
3.2.1.22
Rafinose-free solutions
Termolisina
3.2.24.4
Aspartame
• http://www.chiralvision.com/index.htm
ChiralVision offers a range of immobilized
enzymes under the name Immozymes.
Immobilization offers easier separation
and reuse of enzymes thereby making
your production process more cost
effective. Additionally process conditions
can be chosen with increased flexibility.
Lignocelulosico pre-tratado
imobilizada
Estabilidade térmica
(a 50, 55, 60 e 65 oC)
Perda de atividade a cada
ciclo de uso da enzima devido
a etapa de precipitação para
recuperação da enzima
imobilizada