Enzimas (Parte II)
Bioquímica para Enfermagem
Prof. Dr. Didier Salmon
MSc. Daniel Lima
Cinética Enzimática
• Estudo da velocidade da reação e dos fatores que a influenciam
• Pode ser medido por:
– Quantidade de produto formado por unidade de tempo
– Quantidade de substrato consumido por unidade de tempo
V = -ΔS/Δt = ΔP/Δt
Cinética Enzimática
5[S]
4[S]
3[S]
2[S]
[S]
tempo
Velocidade
da reação
[produto]
Cinética Enzimática
[S]
V0 e Vmáx
• V0 sobe linearmente a medida que se aumenta a concentração de
substrato, e então começa a se nivelar e se aproximar de um ponto
máximo onde a velocidade não aumenta, mesmo em
concentrações maiores de substrato.
Velocidade da reação é
proporcional a S
Substrato satura todas
as moléculas de enzima
V0 e Vmáx
Substrato Único
E+ S
K1
K -1
ES
K2
K -2
Hipótese: etapa limitante
E+P
• Após curto tempo - estabilidade dinâmica com relação a [E] e [ES] é
alcançado
Substrato Único
• Estado estacionário - [ES] constante
– Ou seja: formação do complexo = sua degradação
• V0 é determinado pela quebra de ES formando o produto
– V0 = k2[ES]
• [ES] difícil de determinar. Alternativa!
[Et]=[E] + [ES]
• As velocidades de formação e quebra de ES são determinadas pelas
etapas governadas pelas constantes k1 (formação) e k-1 + k2 (quebra em
reagentes e produtos)
– V de Formação de ES = K1 [E] [S]
– V de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES]
Substrato Único
• Uma vez que a degradação de ES é igual a sua formação, temos:
– k1 ([Et]-[ES]) [S] = k–1[ES] + k2 [ES], ou seja:
– k1[S][Et] - k1[S][ES] = (k–1+ k2) [ES]
– Dessa forma: [ES] =
• Se V0=k2[ES]
– V0 = k2. [Et] [S]
[S] + Km
[Et][S]
[S] + (k-1 + k2)/k1
Km
[Et]=[E] + [ES]
Equação de Michaelis-Menten
• Na Vmax, [ES] = [Et], assim:
– Vmax = k2[Et]
– Substituindo na equação anterior
V0 = k2. [Et] [S]
[S] + Km
temos,
V0 = Vmax [S]
[S] + Km
Propriedade Importante
• Quando V0 = Vmax, temos:
2
Vmax = Vmax [S] ,
2
[S] + Km
Km + [S] = 2 [S],
Km = 2 [S] – [S]
Km = [S]
Km = [S]
• Ou seja, o Km é igual a concentração do substrato quando a velocidade
inicial é metade da velocidade máxima
Km
• Característico de cada enzima.
• Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato.
Equação de Lineweaver-Burk
V e [Enzima]
• A velocidade da reação é proporcional à concentração da enzima
• Facilita a determinação da concentração de uma enzima
• Dosagens (transaminases, LDH, amilase, fosfatase alcalina)
v0
[E]
Mais de um substrato...
• Ex: ATP + d-glicose → ADP + d-glicose-6-fosfato
Mais de um substrato...
• Reações em que há 2 substratos envolvem a transferência de átomos ou
grupos funcionais de um substrato para o outro:
Sequencial (formação do complexo ternário)
Pingue-pongue ou duplo deslocamento
Inibidores
• A atividade das enzimas pode ser diminuída ou parada por várias
substâncias chamadas de inibidores.
• Existem inibidores naturais, fazendo parte dos constituintes da
célula, e outros estranhos ao organismo que podem provocar
alterações do metabolismo celular.
• Aqueles encontrados nas células são fundamentais para a fisiologia
pois permitem às células um controle preciso da velocidade de
algumas reações chave, permitindo uma resposta integrada à
mudança das condições fisiológicas.
• Inhibição específica de certas enzimas permita as aplicações
farmacológicas
– Ex: sulfonamidas: usadas para combater as infecções bacterianas
Sulfonamidas
• Inibidores competitivos da diidropteroato sintetase (dhps), enzima
importante envolvida no metabolismo dos folatos (síntese de DNA e RNA)
de muitos organismos menos o homem.
• Os folatos nos serem humanos são fornecidos pela dieta.
• Toxicidade seletiva para bactérias.
• Utilizados para tratar:
– Pneumonia a pneumocystis
(Pneumocystis jirovici, P. carinii) IO
em pacientes HIV +
– Infecção do trato urinário
– Shigelose (Desinteria)
– Algumas infecções por protozoários
(Plasmodium falciparum)
Inibidores
• Largo campo de aplicação para o combate de insetos
• Ex: enzimas digestivas de insetos como as α-amilases catalisam a hidrólise
de ligações glicosídicas α-1,4 do amido, glicogênio e outros carboidratos.
Essas enzimas são muito importantes para os insetos, especialmente para
aqueles que se desenvolvem em grãos ricos em amido. (No feijão foram
identificados 4 desses inibidores)
• Desenvolvimento de plantas mais resistentes ao
ataque das pragas contribuindo para a redução do uso
de inseticidas químicos.
Inibidores
• Importância:
– Agentes farmacêuticos
– Ferramentas no estudo de mecanismo de funcionamento das enzimas
– Ferramenta nos estudos das vias metabólicas
Irreversíveis
Inib. Competitiva (freqüente)
Reversíveis
Inib. Acompetitiva
(quando o inibidor liga-se ao
complexo ES , mas não a
enzima livre)
Inibidores
Inib. Mista
Inib. Não-competitiva
(caso particular de inib. Mista)
Inibidor Irreversível
• 1-Reagentes específicos para grupo (R)
• 2- Análogos de substrato
• 3- Inibidor suicida
1
2
Inibidores Reversíveis
Semelhança estrutural entre S e I
Não há semelhança estrutural entre S e I
Não há semelhança estrutural entre S e I
• Inibidor
competitivo
– Estrutura
semelhante à do
substrato
– Liga-se ao Sítio
Ativo da enzima
– Aumento da
[substrato]
diminui a inibição
– A Vmax NÃO se
altera
– Km da enzima
AUMENTA na
presença do
inibidor
• Inibidor não
competitivo
– Não tem
estrutura
semelhante à do
substrato
– Não se liga ao
Sítio Ativo da
enzima
– Aumento da
[substrato] não
diminui a inibição
– A Vmax diminui na
presença do
inibidor altera
– Km da enzima não
se altera
Inibição Competitiva
Su bst r at o (m M )
V0 (sem in ibid or )
m m ol .L -1 .m i n -1
5
7.5
1 0.0
1 0.7
1 2.5
1 3.6
1 3.5
0.2
0.4
0.8
1.0
2.0
4.0
6.0
-1
V0 (mol.L .min )
15
Sem inibidor
10
-1
Com inibidor
5
0
0
1
2
3
4
Substrato (mM)
5
6
7
V0 (com in ibid or )
m m ol .L -1 .m i n -1
3
5
7.5
8.3
1 0.7
1 2.5
1 3.5
Inibição Competitiva
Inibição Não-Competitiva
Inibição Incompetitiva
•
O inibidor se liga somente no complexo ES, em sítio próprio
Analgésicos – Inibidores de
Prostaglandinas
• Ligação covalente
– Inibidor irreversível (suicida) - Aspirina
• Interações sem ligação covalente
– Inibidor competitivo e reversível – Ponstan
 Regulação de perfusão renal
Agregação plaquetária
Protetora de mucosa gástrica
Inflamação
Sítio Ativo da COX
Inibidor competitivo e reversível da
COX-1/2 Interação iônica
Dipirona sódica
Inibidor competitivo e reversível da
COX-2
Meloxicam
Inibidores de Proteases do HIV
• Gag e Pol são clivados pela protease do HIV em 9 pontos específicos para
produzir proteínas funcionais.
– O precursor Gag vai originar proteínas estruturais
– O precursor Pol vai originar enzimas como transcriptase reversa,
integrase e proteases.
Amprenavir
Ciclo de replicação do HIV
Enzimas Alostéricas
Sistema multienzimático sequencial
Enzimas Alostéricas
• Analogia com proteínas alostéricas: Hemoglobina
• Moduladores alostéricos (≠ de inibidores não-competitivos ou mistos!!)
• Mudanças conformacionais entre forma ativa e inativa e parâmetros
cinéticos diferentes (≠ do Michaelis-Menten)
• Homotrópicas ou heterotrópicas
Enzimas Alostéricas
• Reguladas por moduladores
alostéricos → envolvendo ou
não o sítio ativo
• Várias subunidades
• Inibição por retroalimentação
• Exemplo: Aspartato
transcarbamilase
• 12 cadeias polipeptídicas
• Azul: catalítica
• Vermelho/Amarela:
regulatórias
Aspartato Transcarbamilase
Síntese de pirimidinas
Modulador Alostérico
• Pode ser tanto um inibidor quanto um ativador.
Michaelis-Menten
Enzimas Alostéricas
Enzima Homotrópica
Efeito moduladores
Efeito moduladores
Exemplos de Enzimas Regulatórias
PFK-1
Modificação Covalente Reversível
Exemplos de Enzimas Regulatórias
Glicogênio Fosforilase
Ativação Proteolítica
Fatores que afetam a Velocidade
Enzimática

pH

Temperatura

Concentração de substratos

Concentração de cofatores

Presença de Inibidores e/ou ativadores

Modificações químicas: fosforilações, adenilações, etc

Concentração de enzima