UnB
Desreguladores endócrinos
Poluentes Ambientais:
relações de causa e efeito
Isabella Gontijo de Sá Leão
Orientador: Francisco de Assis Rocha Neves
Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde/UnB
14 de agosto de 2012
Esta apresentação...
O que são EDCs e como funcionam
O que são POPs e como atuam
Mecanismo de ação dos hormônios que agem em
Receptores Nucleares
Mecanismos de interferência endócrina e metabólica
Hipótese: obesogênicos ambientais?
Adipogênese mediada pela ativação in vitro do
receptor Glicocorticóide_Nature Obesity, 2010
Níveis circulantes de POPs no tecido adiposo visceral e
subcutâneo_Nature Obesity, 2011
Considerações finais
O que mudou depois da revolução
industrial?
 Fatos:
 Queda no número de





espermatozoides
Incidência de câncer (12%
das mortes no planeta) e
malformações (maior
causa de mortes em
crianças até 1 ano)
Depressão e ansiedade
Arritmia e doenças
cardíacas
Diabetes 2
Obesidade
Fatos
Incremento da [ ] CO2
Crescimento das cidades
Desenvolvimento da
indústria farmacêutica
 Uso de insumos plásticos
e metais pesados em
produtos domésticos
 Industrialização da
agricultura
 400 milhões de toneladas
de produtos químicos/ano




Desregulador endócrino ad hoc
Fonte sintética ou
natural
Produção
Secreção
Metabo
lismo
Excreção/
Mimetism
o
Desreguladores endócrinos...
Afetam:
Eixo central:
Hipotálamo-hipófiseadrenal
Regulação dos
Hormônios
esteróides
Fisiologia do
tecido
adiposo
O que é um desregulador endócrino?
‘Endocrine disruptor chemical’
An endocrine disruptor is an
exogenous substance or mixture
that alters functions of the
endocrine system and
consequently causes adverse
health effects in an intact
organism, its progeny, or
(sub)populations
Termo cunhado por
Ana Soto e
colaboradores em 1993.
Poluentes ambientais conhecidos e seus efeitos
Vida média de 8
anos em humanos
Mecanismos de interferência endócrina
Ligação ao
receptor
• Ativação
• Inibição
hormônio
• Inibição
• Feedback positivo
Rotas de
Transporte
• Clearance metabólico
• Associação às proteínas do plasma
Síntese do
Bigsby et al. 1999. Environmental Health Perspectives Vol 107, Supplement 4.
Como avaliar o efeito do interferente
endócrino?
Curva doseresposta
Efeitos adversos
nas concentração
de exposição
Concentrações
saturantes e
efeitos em
diferentes
gerações
Modelos em toxicologia para estudar
EDCs
Bigsby et al. 1999. Environmental Health Perspectives Vol 107, Supplement 4.
Poluentes Orgânicos Persistentes POPs  EDCs
Resistentes à degradação química, biológica e
fotolítica
Estabilidade
Agricultura,
Indústria e
alimentos
Bioacumulação
Mobilidade
ambiental
Biomagnificação
Sobre os POPs...
Silent Spring
Rachel Carson – 1962
Queda na população de Aves
DDT (dicloro-difenil-tricloroetano)
Todos pesticidas organoclorados são
persistentes
Fontes dos POPs
Pesticidas
Agricultura
Pastagens
Matéria-prima
na Indústria
Química
Resíduos de
Insumos
Químicos
Processos de
Combustão
Ligação C-Sn
Estabilizantes
(Plásticos) e
Biocidas
Exemplo:
Organoestânicos
Interferência hormonal
Como os hormônios funcionam?
Receptores de membrana
 Hormônios peptídicos
Ex: insulina
Receptores nucleares
 Pequenos Hormônios
lipolíficos
Ex: estrógeno
O que é um receptor nuclear?
DR-1
Janosek et al. Toxicology in Vitro 20 (2006) 18–37
O que são os PPARs?
- Receptores ativados por proliferadores peroxissomais...PPARs
- Sensor de ‘lipídeos’ ou sensor ‘metabólico’
- Induzem a proliferação de peroxissomos
- PPARa  no fígado  oxidação
de ácidos graxos
Xenopus laevis
O que é o PPARɣ?
- Presente principalmente: tecido adiposo, fígado, pâncreas,
monócitos, macrófagos e trato digestivo.
- Duas isoformas conhecidas – splicing alternativo.
- Papel: diferenciação e proliferação de adipócitos; ativa a
cascata de reações que envolvem a estocagem de ácidos graxos
↑ capacidade de estoque
↑fluxo de ácidos graxos para o adipócito
PPARɣ
PPARɣ1
PPARɣ2
Quem são os ligantes do PPARɣ?
 Naturais
 Sintéticos
Múltiplos mecanismos de ação de EDCs
Porque armazenar energia?
Vertebrados e artrópodes
Sobrevivência
Processos ecológicos:
Migração
Sazonalidade de habitats
Nichos específicos/endêmicos
Hibernação
Lactação
Reserva de emergência
Termorregulação
Proteção mecânica
Territorialidade  fezes
Acasalamento
Cuidado parental (incubação e
aquecimento dos filhotes)
A moeda de energia...
Tecido especializado
Armazenamento
Manejo
Adipócitos – 40 a 85% de triglicerídeos
Oriundos de quilomícrons e LDL
Ácidos graxos de longa cadeia 
preservados nas teias alimentares
Guardam mais energia por unidade de
massa do que os carboidratos
Insolúveis
Compactos
Não-tóxicos para as células mantenedoras
Como o adipócito captura a gordura...
Triglicerídeos
Hidrolisados pela LPL (lipoproteína LIPASE)
LPL
Produzida por Adipócitos e exportada para a superfície de
células endoteliais
Ácidos graxos são então liberados adipócitos
Insulina e Cortisol  ↑ expressão da LPL
Inibem a atividade da LPL:
Testosterona
GH
Catecolaminas
TNF
Carboidratos
Lipídeos
Relação entre massa corpórea e
massa adiposa
Obesidade animal
 0.01 nL  morcego
 4 nL  baleia
(tamanho do adipócito)
- Humanos, ratos e pequenos herbívoros
 0.1 a 1 nL
- Domésticos (40 a 85%)
- Animais selvagens (máx. 46%)
(composição dos adipócitos)
- 10 vezes mais adipócitos do que
Animais naturalmente obesos
- Coelhos, lebres e raposas < 1%
Obesidade...fenótipo ou doença?
 Um dos mais graves e crescentes problemas de saúde pública
do século XXI...
Fig. Proporção de adultos e crianças obesos e com sobrepeso na Inglaterra.
(The Health Survey for England 2009).
Enfrentamos uma
epidemia?
Fig. Relação entre a massa corpórea e mortalidade
cardiovascular em homens e
mulheres americanos que nunca fumaram e sem doenças preexistentes.
in Willians Textbook of Endocrinology, 12th edition, 2011. Melmed et al.
VARIÁVEIS...
Padrão de distribuição da
gordura corporal
Excesso de gordura
abdominal (T.A.visceral):
Hipertensão
Dislipidemia
Doença
coronariana
isquêmica
Idade
Outras doenças
preexistentes
Ganho de peso na idade
adulta
Fig. Relação entre a massa corpórea e o diabetes
Atividade física e aeróbica
tipos dois em mulheres americanas.
Etnia (asiáticos são mais
in Willians Textbook of Endocrinology, 12th edition, 2011.
Melmed et al.
propensos)
...exposição aos EDCs?
Obesidade...
Output
Herança genética X Fatores Ambientais
Comportamento, sono, disponibilidade de
alimento, escolaridade, dieta ocidental...
Input
Sobre EDCs e adipogênese via RNs
Obesity, 2010
F.I.= 4.284
Hipótese inicial...
Ativação do GR indução da adipogênese in vitro
EDCs poderiam:
competir com o cortisol
Alterar atividade da 11-β- hidroxiesteróide desidrogenase 1 e 2 
cortisona  cortisol cortisona (no TA)
Objetivo:
Avaliar ação de EDCs sobre o GR... (inédito em pré-adipócitos)
Screening de EDCs para atividade do GR
Ensaio de gene repórter
Ensaio de diferenciação de adipócitos
Coquetel fraco de DHC (dehidrocorticoesterona)
Coloração com óleo vermelho
Western blot de marcadores do TA
Superfamília de receptores nucleares
Estruturalmente relacionados  homodímeros
recrutam a maquinaria de transcrição  remodelagem da cromatina
Conferem plasticidade fenotípica  adaptação e homeostase
Múltiplas
Versões de
um mesmo
receptor
splicing
alternativo
Estrutura dos receptores nucleares
- 50.000 a 100.00 daltons
+ HAT
Escala de
atuação do
DBD:
-Cromatina
- HDAC 3
(mamíferos)
Estrutura
resolvida
para vários
receptores
Proteínas multifuncionais  transdução do sinal de seus ligantes
Como agem os ligantes de RNs?
Núcleo da célula-alvo  regulam a expressão gênica
‘Universo...’  ENCODE project & The eukaryotic genome as a
RNA machine. Amaral et al. (2008) Science
Lipofílicos
Derivados da dieta ou de precursores metabólicos
Massa < 1000d
São codificados no genoma? Nem todos...
Descoberta  purificação de glândulas
Entrada na célula: difusão ou transporte mediado por proteínas de
membrana
Antagonistas:
LIPOFILICIDADE  absorvidos no trato gastro-intestinal
Potencial para o uso
farmacológico
-Competição com o
ligante
-Sítio próprio
- Recrutam corepressores
Traduzir pistas do ambiente interno e externo
Em mudanças na expressão gênica
in Willians Textbook of Endocrinology, 12th edition, 2011. Melmed et al.
Sinalizam pistas intracelulares e ambientais...
Transduzidas pelos receptores nucleares...
Como agem os glicocorticóides?
Hormônios esteroides  córtex da adrenal
Resposta ao estresse físico e emocional  homeostase
Bloqueiam o processo de inflamação
Suprimem a ativação do sistema imune
Gliconeogênese
↑ glicemia
Mobilização da oxidação de ácidos graxos
Cortisol
Incrível potencial farmacológico
Imunossupressores
Inflamação crônica
Efeitos adversos: diabetes, perda muscular e retardo de
crescimento (inibição do GH) e lipodistrofia
Receptor Glicocorticóide Ad hoc
NR3C1 gene  cromossomo 5 em humanos
Fator de transcrição que também regula outros fatores de transcrição...
Expresso em quase todas as células
Regula genes
Desenvolvimento
Metabolismo
Resposta Imune
Resposta adaptativa ao estresse
Receptor não ligado reside no citoplasma  heat shock proteins
Complexo GR + ligante  translocado para o núcleo
↑ Expressão de proteínas anti-inflamatórias
↓ Expressão de proteínas pró-inflamatórias
Mecanismos de ação
Transativação  GRE  ativação da transcrição
Transrepressão  se liga ao NFᵏB e AP-1 e reprime expressão
Agonistas: Dexametasona, Progesterona e DHEA
Receptor nuclear, subfamília 3, grupo C, membro 1
Vias de sinalização...
http://nrresource.org/Pathways/gr_targets.html
O que se sabe sobre a ação de POPs em RNs?
Casal-Casas & Desvergne. 2011, Annual Review of Physiology, 73:135-162.
Delineamento experimental
Ensaio de gene repórter
• Transfecção transitória e ensaio de gene repórter
RNAm
-Atividade do
receptor
-Expressão gênica
- Transdução de
sinal
- Interação
proteína-proteína
Luciferase
RN
ER
MTB
Luciferina
Luciferase
LUZ
Pré-adipócito
Quantificação
no luminômetro
Figura 01.
Compostos
desreguladores
endócrinos induziram
a expressão da
luciferase.
Objetivo: Screening de
EDCs in vitro
- [ ] dos EDCs testados 
1µmolar/l por 24h
TPT  1 nmol/l
- Ensaio de competição
com a dexametasona
- IC50 de ~ 1µmolar/l
(Johanson et al., 1998)
- Teste t-Students pareado
Tóxico em
[ ] µmolar
Como EDCs ativam a adipogênese?
A ativação do heterodímero RXR-PPAR favorece a
biossíntese de lipídios e seu estoque.
Como EDCs promovem a adipogênese?
Adipócito
maduro
Préadipócito
Insulina
Fatores secretados:
Insulin
a
Adiponectina
Resistina
Dexametasona
Ou EDCs
IBMX
Leptina
Lipídeos
Lipídeos
GR
PPAR C/EBP

AMPc
PPAR

C/EBP
Lipídeos
Síntese de AG
Lipídeos
A expressão simultânea do PPAR e da C/EPBα (CAAT/proteína promotora de
ligação) é sinérgica e mantém o estado diferenciado do adipócito maduro.
Coquetel: 10% SFB+ DMEM+ DHC+INSULINA+ IMBX+EDCs...
Figura 02. Compostos desreguladores endócrinos induziram a adipogênese
in vitro.
1µmolar 100 pmolar/l
11.4 nm/l urina e
290 nm/l no sangue
5.94 nm/l
plasma
-Objetivo: testar o significado fisiológico da ativação do GR
- Sem Dexametasona
não houve diferenciação
-Uso de DHC em vez de Dexa
- DCHP, Endrin e TF  ↑ adipogênese [ ] 1pmolar/l
Figura 03. Indução da adipogênese in vitro por EDCs dependente da dose.
1µmolar 1 fmolar/l
A expressão
proteica foi
comparada com
o lisado de préadipócitos
indiferenciados
- Objetivo: Curva dose resposta com o DCHP
(ftalato) em [ ] < 1µmolar/l
- Atividade observada  [ ] pmolar
Figura 04. EDCs induzem a acumulação de lipídeos no ensaio de
adipogênese na linhagem de pré-adipócitos murinos 3T3-L1.
O acúmulo de
lipídeos
aumentou em
87% após a
adição de
dexametasona
ao coquetel de
diferenciação.
- Objetivo: Caracterizar as propriedades pró-adipogênicas dos EDCs:
avaliar a capacidade de acumular lipídeos em comparação ao
coquetel simples sem dexametasona.
- Absorbância de 500 nm após a extração do Óleo vermelho com
isopropanol determinada no espectrofotômetro.
EDCs com atividade endócrina relatada...
ENDRIN
DCHP
ENDRIN,
organoclorado,
inseticida de
uso mundial
DCHP, ftalato,
plastificante,
precursor de
PVC
BPA
TF
Ativação do GR
Bisfenol A,
precursor de
insumos plásticos,
banido no Brasil
em 2010
Tolilfluanida, TF,
fungicida de
amplo uso na
agricultura
Em síntese...
Os quatro principais EDCs testados
↑ a quantidade de lipídeos acumulados
↑ a expressão de proteínas específicas dos adipócitos
Evidências de efeitos pró-adipogênicos  [ ]s picomolares
EDCs + outros fatores endógenos = efeito sinérgico na adipogênese
Estudos anteriores  Adipogênse via PPARɣ, no entanto os agonistas de
GR não o estimularam
EDCs não substituem o efeito da Dexa na diferenciação
Interferência na sinalização do GR  desregulação metabólica?
Obesogênico?
Estudos com hexaclorobenzeno sugerem ↓ na expressão do GR
Os efeitos observados podem ser mediados através de alterações na
atividade da 11-β- hidroxiesteróide desidrogenase 1 e 2
EDCs  alterações alostéricas na interação com o ligante ao LBD do GR
PPARɣ e GR  diferentes fenótipos: Sensibilidade X Resistência Insulínica
Quais são os
efeitos deletérios
de potenciais
glicocorticóides
ambientais?
POPs presentes no tecido adiposo humano
Obesity, 2012
F.I.= 4.284
Entendendo a hipótese...
Níveis circulantes de POPs  plasma X obesidade
Níveis circulantes de POPs  distribuição do tecido adiposo
Visceral
Subcutâneo
Ressonância magnética abdominal
Tipos de estudo: corte transversal e prospectivo
Medições feitas num único momento  prevalência (fator causal e efeito de uma
patologia
PIVUS  Investigação Vascular Prospectiva de Idosos de Uppsala
(estudo de coorte)
in Willians Textbook of Endocrinology, 12th edition,2011. Melmed et al.
Perfil do estudo...
Análises:
- Níveis de 21 POPs no plasma
sanguíneo
X
-Áreas de tecido adiposo visceral
e subcutâneo (MRI)
 Subamostra de 287 indivíduos
-Relação VAT/SAT (distribuição da
gordura abdominal)
Amostra populacional:
- 1016 indivíduos (homens e
mulheres) com 70 anos de idade
- Vivem em Uppsala (70 km de
Estocolmo)
-Variáveis:
 Gênero
Nível educacional
 Nível de atividade física
 Uso de cigarro e medicamentos
PCBs
Dioxinas
↓
Clorados
Obesidade
Relação positiva confirmada entre
um aumento nas concentrações
plasmáticas de POPs e a obesidade
(medidas da cincunferência da
cintura e [ ] de POPs. Lee et al.
2012
Análise dos POPs
Cromatografia de gás de alta
Resolução e espectrometria de
Massa de alta resolução
(conjugados)
- Concentração de POPs no
Plasma  lipídeos ng/g de
Lipídeo
- 10 mm Steady-state free
Precession slice imaging
 MRI técnica
- ANOVA (Análise da variância)
- Análise de relação não-lineares
(não monotônicas)
Influência dos POPs sobrepeso e obesidade no plasma
Influência dos POPs sobrepeso e obesidade no VAT e SAT
Em síntese...
Relações não lineares com dados adicionais:
Consumo calórico
Percentual de gordura ingerida
Apenas efeitos marginais, sem alterar a significância dos resultados
OCs < 5 substituíçoes cloradas  correlação positiva com a presença
de gordura abdominal (visceral e subcutânea)
Ocs > 6 substituições  correlação negativa
PCB 189
Papel na deposição do TA?
Relação com downregulation de
Receptores em ↑ [ ]s?
Novidade metodológica
Resultados diferentes com populações
mais jovens
Complexidade do estudo de EDCs
Pausa para reflexão...
- Novos POPs para
Estocolmo
-(Decreto 5472 de
20 de junho de 2005)
- Sustentabilidade
O que a indústria farmacêutica
planeja ganhar com os
obesos?
Observações gerais...
 Abuso do termo ‘função’
Agora é com vocês...
Perguntas para os ouvintes...
Como os EDCs podem ativar a adipogênese?
Como é o mecanismo de ação dos hormônios que
atuam em receptores nucleares?
O que é um obesogênico?
"Em um mundo repleto de consumidores e produtos, a vida flutua
desconfortavelmente entre os prazeres do consumo e os horrores da pilha de lixo"
Zygmunt Bauman
Obrigada!
[email protected]
Combate à teleologia...
A teleologia (do grego τέλος,)
é o estudo filosófico dos fins, isto
é, do propósito, objetivo ou
finalidade.
Obrigada!
[email protected]
Referências...
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