ESTSP - Escola Superior de Tecnologia da Saúde do Porto
Curso: Mestrado em Tecnologia Bioquímica em Saúde
Unidade Curricular: Técnicas de Diagnóstico Bioquímico e Molecular I
Ano Lectivo: 2012/2013
Ano curricular: 1
Período Lectivo: 1º Trimestre
Frequência: Obrigatória
Nº créditos (ECTS): 4.0
Horas teóricas: 15.0 h
Horas teórico/práticas: 5.0 h
Docente Responsável: Ruben Fernandes
Objectivos:
No final da unidade curricular o estudante tem de ser capaz de:
*Compreender a importância do diagnóstico bioquímico e molecular no contexto das doenças genéticas, do metabolismo,
oncológicas e infecciosas;
Reconhecer a importância das diferentes tecnologias do DNA recombinante no contexto do diagnóstico laboratorial clínico.
*Compreender os princípios físico-químicos subjacentes às diferentes tecnologias de análise biomolecular.
*Reconhecer a importância das diferentes tecnologias imunoquímicas e de citologia analítica no contexto do *diagnóstico
laboratorial clínico.
Compreender as técnicas laboratoriais de análise qualitativa e quantitativa no contexto do diagnóstico laboratorial clínico.
*Demonstrar saber aplicar em contexto individual e personalizado correctas as metodologias de análise biomolecular na resolução
de um problema em contexto de trabalho.
Programa:
1. Introdução ao diagnóstico molecular em medicina (2 horas)
1.1. Doenças monogénicas
1.2. Doenças poligénicas
1.3. Biologia forense
1.3.1. CODIS
1.3.2. STRs
1.4. Tipagem HLA
1.4.1. Tipagem Celular por FACS
1.4.2. Genotipagem por PCR
1.4.3. Genotipagem por Microarrays
1.5. Farmacogenómica
1.5.1. Citocromo P450
1.6. Susceptibilidade a doenças infecciosas
1.6.1. Susceptibilidade genética: SCID
1.6.2. Resistência genética: HIV
1.7. Doenças infecciosas
1.7.1. Virologia
1.7.2. Bacteriologia
1.7.3. Resistência aos antibióticos
1.8. Epidemiologia molecular
1.8.1. Filogenética
1.8.2. Fingerprinting (genotipagem)
2. Biossíntese e função de macromoléculas (1 horas)
2.1. Estrutura do DNA e RNA
2.1.1. Organização do DNA
2.1.2. RNAs codificantes e não codificantes
2.1.3. RNA de interferência
2.2. Expressão genética e síntese proteica
2.2.1. Transcrição
2.2.2. Maquinaria de transcrição procariótica e eucariótica
2.2.3. Edição do RNA
2.2.4. Síntese proteica
2.2.5. Modificações pós-translacionais
3. Engenharia Genética (2 horas + 3 horas TP)
3.1. Enzimas que modificam ácidos nucleicos
3.2. Sistemas e vectores de clonagem
3.2.1. Plasmídeos
3.2.2. Cosmídeos e fagmídos
3.2.3. YACs, BACs
3.2.3. Transformação, conjugação, transfeção e electroporação
3.3. Sistemas de selecção de recombinantes
3.3.1. Antibióticos
3.3.2. Sistemas auxotróficos
3.3.3. Proteínas fluorescentes
3.4. Sistemas de produção de proteínas recombinantes
3.5. Bibliotecas genómicas (genotecas)
3.6. Hibridação de ácidos nucleicos
3.6.1. Southern blotting
3.6.2. Northern blotting
4. Amplificação de ácidos nucleicos - PCR (2 horas + 2 horas TP)
4.1. Amplificações pela polimerase
4.1.1. PCR
4.1.2. RFLP-PCR
4.1.3. RAPD-PCR
4.1.4. Multiplex PCR
4.1.5. PCR Multiplex alelo específico
4.1.6. PCR Longo
4.1.7. PCR Competitivo
4.1.8. PCR colony
4.1.9. Touchdown (gradiente) e Hot Start
4.1.10. PCR Degenerado
4.1.11. PCR In situ
4.1.12. PCR Inverso
4.1.13. RACE
4.1.14. Nested PCR
4.1.15. RT-PCR / RT-PCR
4.1.16. Methylation Spectific PCR (MS-PCR)
4.2. PCR em tempo real
4.2.1. Conceitos
4.2.2. Syber-green
4.2.3. Sondas
4.2.4. Curvas de calibração e quantificação
4.3. Aplicações pela ligase
4.3.1. LCR
4.3.2. MLPA
4.4. Métodos especiais
4.4.1. DNA ramificado (bDNA)
4.4.2. Ribotipagem
5. Cromatografia e electroforese (1 horas)
5.1. Proteínas
5.1.1. Electroforese
5.1.1.1. Tipos de matrizes
5.1.1.2. Electroforese nativa (PAGE)
5.1.1.3. Electroforese desnaturante (SDS-PAGE)
5.1.1.4. Focagem isoeléctrica (IEF)
5.1.1.5. Géis 2D
5.1.2. Cromatografias
5.1.2.1. De camada fina (TLC)
5.1.2.2. Permuta iónica
5.1.2.3. Afinidade / Imunoafinidade
5.1.2.4. HPLC
5.1.2.5. GC
5.2. Ácidos nucleicos
5.2.1. Electroforese
5.2.1.1. Agarose
5.2.1.2. PFGE: Pulsed field gel electrophoresis
5.2.1.3. Electroforese capilar (EC)
5.2.2. HPLC desnaturante (DHPLC)
5.2.2.1. EC vs DHPLC
6. Fundamentos de fluorescência (1,5 horas)
6.1. Espectro electromagnético da luz visível
6.1.1. Amplitude de onda
6.1.2. Comprimento de onda
6.1.3. Frequência
6.2. Fluoróforo
6.2.1. Estado fundamental
6.2.2. Estado excitado
6.3. Diagrama de Jablonski
6.4. Lei de Kasha
6.5. Lei de Planck
6.6. Desvio de Stokes (Stokes shift)
6.7. FRET - Förster resonance energy transfer
6.7.1. Cromóforos e fluoróforos
6.7.2. Quenching
6.7.3. Detecção in vivo da interacção de proteínas
6.7.4. Sondas moleculares
6.8. Microscopia
6.8.1. Fluoróforos usados em microscopia
6.8.2. Photobleaching (decaimento)
6.8.3. Métodos para minimizar o decaimento
6.8.4. Filtros
6.8.5. Espelhos dicróicos
6.8.6. Microscopia de fluorescência
6.8.7. Microscopia confocal
7. Métodos de fluorescência em citogenética (1,5 hora)
7.1. Citogenética clássica vs citogenética convencional
7.1.1. Hibridação in situ
7.1.2. Sondas e DNA alvo
7.1.2.1. Desnaturação
7.1.2.2. Renaturação / hibridação
7.2. Preparação da amostra
7.2.1. Tipos de material biológico
7.2.2. Fixação
7.2.3. Pré-tratamento das lâminas
7.3. Tipos de sonda
7.3.1. Sequência repetitiva
7.3.2. Single copy sequences
7.3.3. Chromosome paiting
7.4. Marcação das sondas
7.4.1. Nick translation
7.4.2. Random primed labelling
7.4.3. PCR
7.5. Imunodectecção
7.5.1. Marcação directa vs marcação indirecta
7.5.2. Amplificação de sinal
7.5.3. Método ABC
7.5.4. Método Streptavidina-biotina
7.5.5. Polímeros com Horsereadish-Peroxidase
7.6. Técnicas especiais de FISH
7.6.1. SKY-FISH
7.6.2. Zoo-FISH
7.6.3. Fiber-FISH
7.6.4. PRINS
7.6.5. CGH
7.6.6. PNA-FISH
7.6.7. DNA microarrays / CGH microarrays
7.6.8. Flow-cytometry FISH
8. Métodos de fluorescência em citologia analítica (4 horas)
8.1. Imunoquímica
8.1.1. ELISA
8.1.2. Western-blotting
8.2. Citometria de flurorescência
8.2.1. Tipos de citometros
8.2.2. Dinâmica de fluídos
8.2.3. Sondas fluorescentes
8.2.4. Análise multiparamétrica
8.2.5. Case studies
Objectivos:
As aulas são leccionadas em auditório recorrendo à projecção de diapositivos, utilização de transparências, assim como, a
projecção de apresentações em "power point" e CD-ROMs interactivos, utilizando os métodos expositivo e interrogativo, embora
também se propicie aprendizagem activa com recurso a novas tecnologias.
Métodos de Avaliação:
ESTSP/P - 13/2011 em vigor, nesta unidade curricular será obtida numa escala de 0 a 20 e resulta da aplicação da seguinte
expressão:
NF = TE + TG
A nota final (NF) será obtida por realização de um teste escrito (TT) expresso numa escala de 0 a 15 e de um relatório do trabalho
de grupo (TG) formado por 2 a 3 elementos, expresso numa escala de 0 a 5.
A realização do trabalho de grupo será optativa (nota zero). Consiste numa revisão em inglês da literatura, de um tema no âmbito
da UC.
A avaliação por exame final, nos termos do Regulamento de Frequência e Avaliação ESTSP/P - 13/2011 em vigor, será expressa
numa escala de 0 a 20. O exame avaliará os conhecimentos adquiridos nas aulas e os temas abordados nos trabalhos práticos
numa proporção identifica à expressão NF.
Bibliografia:
BIBLIOGRAFIA DE REFERÊNCIA
* Wink M (Editor) An Introduction to Molecular Biotechnology: Molecular Fundamentals, Methods and Applications in Modern
Biotechnology. Wiley-VCH (Última edição).
* Patrinos G, Ansorge W (Editors). Molecular Diagnostics. Elsevier Academic Press (Última edição).
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTAR
* Strachan, Read (Editor) Human Molecular Genetics 2. Garland Science Textbooks
* Watson, Caudy, Myers, Witkowski (Editor) Recombinant DNA: Genes and Genomes - A Short Course. W.H. Freeman (Última
edição)
* Persing, Tenover, Versalovic, Tang, Unger, Relman, White (Editor) Molecular Microbiology: Diagnostic Principles and Practice.
ASM (Última edição)
Observações:
Docentes:
Prof. Doutor Rúben Fernandes - [email protected] (Regente)
Profa. Doutora Cristina Prudêncio - [email protected]
Mestre Joana Almeida - [email protected]
Ruben Fernandes
Vila Nova de Gaia, 26 de Julho de 2012