PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO PARANÁ
PRÓ-REITORIA DE GRADUAÇÃO, PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
PIBIC - 2009/10
Desenvolvimento de um protocolo de
micropropagação para Jaracatia spinosa
(Aubl.) A.DC.
PROJETO DE ORIGEM:
PROPAGAÇÃO DE ESPÉCIES FRUTÍFERAS NATIVAS DA REGIÃO OESTE DO
PARANÁ
PLANO DE TRABALHO DE PESQUISA DO ALUNO
PIBIC 2009 - 2010
Curitiba
Abril/Maio de 2009
SUMÁRIO
1.
Introdução e contextualização ............................................................... 1
2.
Objetivo ................................................................................................. 3
3.
Roteiro de atividades do aluno .............................................................. 3
4.
Cronograma .......................................................................................... 4
5.
Referências Bibliográficas......................................................................6
PIBIC 2009/10 – Plano de Trabalho do Aluno
1. INTRODUÇÃO E
CONTEXTUALIZAÇÃO
O Jaracatia spinosa (Aubl.) A. DC é uma espécie arbórea nativa,
pertencente à família Caricaceae, ao grupo das angiospermas. Possui ampla
distribuição geográfica com ocorrência do sul da Bahia até o Rio Grande do Sul,
Minas Gerais e Mato Grosso do Sul, em várias formações florestais. É conhecida
pelos nomes populares de jaracatiá, mamãozinho, barrigudo, chamburu, mamãode-veado, mamão-do-mato, mamoeiro-bravo, mamoeiro-de-espinho, mamãozinhoda-mata. É uma planta lactescente, dióica e espinhenta, de 10-20 m de altura,
com tronco de 70-90 cm de diâmetro, possui folhas compostas palmatilobadas,
com 8-12 folíolos glabros (LORENZI, 2002).
A madeira desta espécie é leve, macia, de fácil manuseio e baixíssima
durabilidade sob quaisquer condições. Possui um grande potencial de exploração,
devido à fabricação de doces caseiros à partir do caule e dos frutos desta árvore
(LORENZI, 2002). Segundo Muniz et al. (2004), as fibras produzidas pela planta
podem originar celulose e papel de ótima qualidade, alta resistência e baixo custo.
Seus frutos são comestíveis e amplamente procurados por pássaros e
macacos (LORENZI, 2002), que são os responsáveis pela dispersão de suas
sementes. Animais frugívoros dependem da disponibilidade de frutos para sua
permanência em determinada área, além de estarem intimamente relacionados à
estruturas genéticas e demográficas de plantas zoocóricas, em decorrência da
dispersão de suas sementes (WRIGHT et al., 1999). A dispersão de sementes é o
processo pelo qual as sementes são removidas da planta-mãe e transportadas
para regiões distantes e mais seguras, onde a predação e a competição são mais
baixas, consistindo em um processo fundamental para o ciclo de vida do Jaracatiá,
que é uma espécie dependente da distribuição zoocórica (TRABAQUINI et al.,
2007).
A diminuição e à extinção da fauna nas matas, em regiões menos
preservadas, contribui para a baixa dispersão de sementes, influenciando nas
interações entre plantas e animais, afetando o recrutamento nas populações de
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PIBIC 2009/10 – Plano de Trabalho do Aluno
plântulas, acarretando mudanças no padrão espacial, de regeneração e
diversidade de espécies (WRIGHT, 2003).
Por ser o jaracatiá uma planta pioneira adaptada à luminosidade direta, e
de crescimento rápido, esta deve ser presença obrigatória em qualquer
reflorestamento heterogêneo destinado à recomposição da vegetação de áreas
degradadas de preservação permanente (LORENZI, 2002).
A espécie está incluída na lista vermelha de plantas ameaçadas de extinção
no Estado do Paraná (PARANÁ, 1995) e do Rio Grande do Sul (SEMA, 2002). O
processo de extinção afeta diretamente o ecossistema, causando graves
desequilíbrios ambientais, é neste contexto que um protocolo de micropropagação
de Jaracatia spinosa merece destaque, visto que não se encontra relatos de
trabalhos sobre micropropagação desta espécie.
A micropropagação é uma técnica dentro da cultura de tecidos que
possibilita propagar células ou tecidos vegetais em tubos de ensaio com meio
nutritivo adequado, sob condições assépticas e com fatores ambientais
controlados (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
O método baseia-se na produção de plantas mais uniformes, sadias e a
uma velocidade muito maior do que os métodos convencionais, sem considerar a
manutenção de quantidades consideráveis de plantas por metro quadrado dentro
de frascos em laboratórios protegidos do ataque de pragas, doenças e intempéries
(LEE et al., 1995 e KERBAUY, 1997).
Essa técnica tem se mostrado de enorme importância prática e potencial
nas áreas agrícola e florestal, bem como no auxílio a programas de melhoramento
genético, na propagação de plantas cultivadas livres de patógenos e na produção
em larga escala de plantas para fins comerciais (CID, 2001).
O protocolo de micropropagação para Jaracatiá permitirá estabelecer
padrão para a multiplicação massal de mudas da espécie, proporcionando
condições adequadas para o isolamento de doenças, melhoramento da qualidade
fitossanitária, e obtenção de grande quantidade de plantas uniformes em curto
espaço de tempo.
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PIBIC 2009/10 – Plano de Trabalho do Aluno
2. OBJETIVO
- Desenvolver um protocolo de micropropagação para Jaracatia spinosa
(Aubl.) A. DC testando a germinação in vitro, o tempo de assepsia de explantes, o
tipo de explante em potencial para o cultivo in vitro, os efeitos de reguladores
vegetais na multiplicação e enraizamento das plântulas, bem como a aclimatação
das plântulas micropropagadas.
3. ROTEIRO DE ATIVIDADES DO
ALUNO
Para o desenvolvimento de um protocolo regenerativo de Jaracatiá
(Jaracatia spinosa (Aubl.) A. DC) in vitro, através da cultura de tecidos, serão
conduzidos diferentes experimentos, no Laboratório de Tecnologia de Sementes
da PUCPR – Campus Toledo, de agosto de 2009 a julho de 2011. Para a
realização dos experimentos serão utilizadas sementes que foram coletadas em
março de 2009, bem como mudas que serão propagadas na casa de vegetação
após a parte I deste projeto.
Será testada primeiramente a germinação in vitro para verificar o potencial
de germinação da espécie, além do fato destas plântulas germinadas in vitro
servirem como fonte de explante para a micropropagação. Sendo assim, deverá
ser realizada a desinfestação das sementes, em câmara de fluxo laminar, através
da imersão em álcool 70% por 2 minutos, hipoclorito de sódio 20% do produto
comercial de uso doméstico (2,5% p.a.), e três gotas/100mL de Tween 20, por 10
minutos. Em seguida, será realizada a tríplice lavagem em água destilada
autoclavada.
As sementes desinfestadas serão inoculadas em frascos tampados com
papel alumínio e vedados com papel filme, contendo 50 mL de meio de cultura MS
(MURASHIGE; SKOOG, 1962), acrescidos de 30 g/L de sacarose, 7% de ágar e
pH ajustado para 5,8 antes da adição do Agar. As avaliações serão realizadas a
cada 7 dias quanto a percentagem de germinação.
Segmentos foliares basais, pecíolos, segmentos de caule, ápices foliares,
radiculares e caulinares serão retirados de plântulas obtidas da germinação in vitro
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PIBIC 2009/10 – Plano de Trabalho do Aluno
e inoculados em placas de Petri contendo meio de cultura MS, 30 g/L de sacarose
e
7%
de
Agar,
sendo
testadas
diferentes
concentrções
de
BAP
(6-
benzilaminopurina) e de ANA (ácido naftalenoacético).
Após a inoculação, as placas de Petri serão mantidas no escuro por 7 dias
para diminuir a incidência de oxidação fenólica para então serem transferidas para
a sala de crescimento, sob fotoperíodo de 16 horas luz / 8 horas escuro e
temperatura de 25 ± 2º C. As avaliações serão realizadas em intervalos de 7 dias,
quanto ao número médio de brotos, folhas e gemas por explante, comprimento da
maior brotação e presença e ausência de calos, durante 60 dias de cultivo.
O delineamento experimental utilizado neste experimento será inteiramente
casualizado com dez explantes por placa e cinco repetições por tratamento. A
análise estatística empregada será análise de regressão através do programa
computacional utilizando o software SISVAR (FERREIRA, 1999).
Para as fontes de explante provindas de mudas propagadas em casa de
vegetação, serão realizados experimentos com o intuito de estabelecer um
protocolo de regeneração para a espécie, neste sentido será testado diferentes
tempos de assepsia, para um determinado tipo de explante, o mesmo método
utilizado para as sementes, anteriormente citado, porém com diferentes tempos
(10, 15, 20, 25 e 30 minutos) de imersão em hipoclorito de sódio (20%).
Após a desinfestação os explantes serão inoculados em frascos da mesma
maneira que foi citado anteriormente para a germinação. Após a inoculação, os
frascos serão mantidos no escuro por 7 dias e então transferidos para a sala de
crescimento. As avaliações serão realizadas em intervalos de 7 dias, durante 30
dias, quanto à presença de contaminação sobre os explantes e a oxidação dos
mesmos. O delineamento experimental será inteiramente casualizado com um
explante por frasco e cinco frascos por tratamento. Os dados serão submetidos à
análise de variância, e suas médias comparadas pelo teste de Tukey (5%).
Através do resultado do teste de assepsia, serão testados diferentes tipos
de explantes pré-definidos, passando os mesmos pelo método de assepsia que
obteve melhor resultado, sendo inoculados em meio de cultura MS, com diferentes
concentrações de BAP e de ANA. O explante que pela análise análise de
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PIBIC 2009/10 – Plano de Trabalho do Aluno
regressão demonstrar ser mais promissor para o cultivo in vitro será utilizado para
a fase de teste de reguladores vegetais para obter maior número de brotações,
bem como posterior enraizamento.
As avaliações serão realizadas aos 30 dias após a inoculação (DAI), quanto
ao número de brotações por explante e a altura média das brotações (cm). Após a
avaliação será realizada a repicagem das brotações e inoculadas nos mesmos
meio de cultura, e então feita novas avaliações aos 30 e 60 dias após a
transferência (DAT). Passados o período de 60 dias as brotações multiplicadas
serão transferidas para frascos contendo meio de cultura MS com outras
concentrações de reguladores para o enraizamento, onde permaneceram por mais
30 dias. Os dados serão submetidos à analise estatística.
A fase de aclimatação ocorrerá após a fase de elongação da parte aérea e
enraizamento das plântulas, sendo escolhidas através de um padrão visual,
buscando a uniformidade das plântulas para a aclimatação. Após o processo de
aclimatação será determinado o número de plantas que sobreviverão.
4. CRONOGRAMA
Meses
Atividades
A
S
O
N
D
x
x
x
Rev.bibliográfica
x
x
Preparo de
soluções estoque
Preparo meio de
cultura
Germinação in vitro
x
x
x
x
x
x
Propagação de
explantes
germinados in vitro
Obtenção de
mudas
Teste de assepsia
Teste de explantes
Teste de Reg. Veg.
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F
M
A
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J
J
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Aclimatação
Análise e
interpretação dos
resultados
Publicação do
projeto
Relatório
J
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x
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x
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5
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x
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5. REFERÊNCIAS
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