A propagação in vitro de plantas.
CULTURA DE TECIDOS
O que é isso?
Cultura de tecidos vegetais - uma ferramenta fundamental no estudo da biologia moderna de plantas.
L. Pedro Barrueto Cid
Biólogo M.Sc. – Ph.D
Embrapa/Cenargen - Área de Biologia Celular
Autor do livro "O método científico, o cientista e a
sociedade", pela editora da Universidade do Amazonas.
[email protected]
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Definição
Antecedentes históricos
A propagação in vitro de plantas,
Figs.1 e 2, chamada também micropropagação, é uma técnica para propagar
plantas dentro de tubos de ensaios ou
similares de vidro (por isso, o termo in
vitro), sob adequadas condições de
assepsia, nutrição e fatores ambientais
como luz, temperatura, 02 e CO2.
É uma parte importante de biotecnologia, conjuntamente com outras
duas áreas: DNA recombinante e fermentação. A cultura in vitro, apresenta
diferentes modalidades conforme os
objetivos de sua aplicação, como por
exemplo, cultura de protoplastos; anteras; calos (Fig. 3); células em suspensão (Fig. 4); sementes (Figs. 5 e 6),etc.
A teoria da totipotencialidade formulada por Matthias Schleiden & Theodor Schwann, em 1838, pode ser dita
que constitui um dos primeiros fundamentos da cultura in vitro, embora
seus formuladores nem tenham imaginado uma metodologia como essa.
A teoria afirma que a célula é autônoma, portanto, que contém o potencial necessário para originar um organismo completo; nesse caso, uma planta
completa. É claro que essa capacidade
deve manifestar-se sob especiais condições de estímulo. Em decorrência
desta teoria, células com diferentes
fenótipos dentro da planta têm idéntico genótipo. Haberlandt, um fisiólogo
vegetal austro-húngaro, por volta de
1902, imbuído dessa teoria, foi o primeiro a manipular um sistema de cultura in vitro de plantas, procurando estabelecer e consolidar um sistema de
micropropagação. Infelizmente, por limitações técnicas da época, seus esforços falharam. Contudo, alguns anos
mais tarde a partir dos trabalhos de
Robbin (1922) e White (1934) em ponta
de raízes; cultura de embriões, por La
Rue (1936); cultura de calos, por Gautheret Nobécourt (1939); enriquecimento de meios nutritivos com leite de
coco, por van Overbeek, 1941; uso de
plantas de tabaco como modelo experimental para estudo de morfogênese,
por Skoog, desde 1944, e uso de meristemas apicais na obtenção de plantas
livres de vírus, por Morel & Martin,
1952, abriram-se as estradas que a cultura de tecido de plantas percorreria
triunfalmente ao longo de todo o século
XX, com mais e mais descobertas e
aplicações.
Importância
Fig.1: Plântula de café cv Rubi, crescida in vitro e obtida a partir
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de gema axilar de uma outra plântula similar a ela. Assim por
diante, outros clones podem ser obtidos
A cultura in vitro de plantas, é uma
técnica que não apenas apresenta importância prática na área florestal e
agrícola, mas, também na científica
básica.
Dentro do campo da biologia de
plantas talvez seja uma das técnicas
mais polivalentes. Assim, através da
cultura de protoplastos, podem-se hibridizar variedades diferentes, vencendo barreiras genéticas. Através da cultura de anteras, podem-se obter plantas
haplóides, que logo depois podem-se
diploidizar e transformar-se em homozigotos, isto é, indivíduos que produ-
zem um só tipo de gameta para um
determinado locus. Com a cultura de
células em meio líquido, podem-se obter
mutantes, isto é, genótipos que ganharam ou perderam alguma característica
específica. Com a cultura de embriões e
meristemas, podem-se fazer trabalhos
de criopreservação para conservar materiais em bancos de germoplasmas, com
economia de espaço e dinheiro, especialmente em espécies de reprodução
assexuada como batata, mandioca, abacaxi etc. Com a cultura de meristemas
apicais, pode-se pensar em obter plantas
livres de vírus, e com a cultura de gemas
axilares (Fig.7), propagar milhares de
plantas, com genótipos superiores, por
exemplo resistentes a nematóides, Fusarium etc. (Fig.8). Na mesma linha de
raciocínio, a embriogênese somática
(Fig.9), pode fornecer grandes quantidades de plântulas que podem servir de
base para plantios no campo, tanto na
área florestal quanto na agronômica e na
hortigranjeira. Por outro lado, a cultura
de tecidos dá suporte técnico a trabalhos
de transformação na área da genética e
na obtenção de plantas transgênicas,
hoje, assunto da moda e muito controvertido. No campo da aplicação básica, a
cultura de tecidos dá suporte técnico
também à bioquímica, à fisiologia vegetal, à fitopatologia e à citogenética. Na
bioquímica, para estudo e dilucidação
de rotas metabólicas. Na fisiologia, para
estudos de crescimento e desenvolvimento, efeito de metais pesados etc., na
fitopatologia, para estudos de toxinas; e na
citogenética, para estudos de cromossomos
ou aberrações cromossômicas (quebras cromossômicas).
Apesar de toda essa
diversidade de técnicas, a cultura de tecido
é uma só, e o denominador comum de todas
elas é: a assepsia, o
explante, o meio nutritivo e os fatores ambientais: luz, temperatura, C02 e 02.
Assepsia
Será entendida como um conjunto de
procedimentos para tornar um explante
livre de microrganismos (bactérias, fun-
Fig.2: Plântula de
banana obtida “in vitro”
e transferida para terra
em casa de vegetação
gos filamentosos, leveduras etc).
A respeito de como evitar microrganismos que possam contaminar o
explante, é inevitável o uso de antissépticos, sejam estes bacteriostáticos
ou germinicidas. Esses antissépticos
podem ser antibióticos ou de outra
natureza, como álcoois (álcool etílico);
halogênios (hipoclorito de sódio); sais
de metais pesados (bicloreto de mercúrio), fungicidas orgânicos etc. Em
relação à vidraria e aos meios de cultura, estes devem ser esterilizados para
que se destruam todos os microrganismos, por calor seco (forno, ar quente)
ou úmido (autoclave). Pinças bisturis e
Fig.3: Calo friável oriundo de
raízes de plântulas de eucalipto
in vitro (Eucalyptus grandis x
E.urophylla)
demais utencilios metálicos para a manipulação do tecido podem ser esterilizados por flambagem direta, como
por exemplo: lamparina com álcool ou
bico de Bunsen na câmara de fluxo
laminar, ambiente este axênico (livre
de germes) portanto, adequado para o
trabalho in vitro.
Explante
Dentro da terminologia da cultura
de tecidos, em geral, explante é qualquer segmento de tecido oriundo de
uma planta para iniciar uma cultura in
vitro, geralmente com as vistas a estabeler um protocolo de
plantas de genótipo superior. Assim, o explante
pode ser um ápice radicular ou caulinar, uma gema
axilar (Fig.7), um segmento de folha jovem (Fig.
10), uma antera, um ovário, um embrião zigótico,
etc. Esses explantes poderão devir plantas diretamente, ou passar por uma
etapa intermediária de
calo, antes de a planta ser
obtida. Um calo é uma
massa de células não diferenciadas do ponto de vista organogênico (brotos,
raízes, frutos etc), que está
em contínua proliferação
celular, podendo ser compactos, friáveis, esbranquiçados ou amarelados Fig. 3, etc.
Podemos realizar indução de plântulas a partir de um calo, com hormôBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento
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Fig.4: Aspecto microscópico
de um conglomerado de
células em suspensão, obtidas
a partir de calos friáveis de
raízes de plântulas de
eucalipto in vitro
nios vegetais ou reguladores do crescimento (estes últimos de ação hormonal, mas de origem sintética). Assim, numa reviravolta espetacular
(morfogênese) o calo começa a induzir brotos, mas a base molecular do
fenômeno na célula, ainda não é
especificamente conhecida, por isso
também a dificuldade de extrapolar
protocolos de micropropagação de
uma espécie para outra, ou de uma
variedade para outra. Contudo, muitas vezes, a incapacidade de induzir
brotos pode estar relacionada com a
poliploidia ou com aberrações cro-
mossômicas. Por
outro lado, discute-se muito se a
obtenção de plantas via calo é um
bom sistema para
clonar plantas
com fins comerciais. Embora a preocupação seja pertinente, há também nessa preocupação muita
carga especulativa. Dentro da biologia, clone é um
termo de origem
botânica e representa a idéia de
plantas que se originam de uma mesma matriz e, supostamente, possuem o
mesmo genótipo. Em cultura de tecidos, isso não necessariamente pode
ser verdade, por isso, então, essa dificuldade de aceitar sem suspeitas plantas via calo. Quando essa variabilidade
morfogenética acontece a denominamos variação somaclonal, embora
ela seja indesejável para a propagação
clonal, ela possui muito potencial no
estudos de melhoramento de plantas.
Meio nutritivo
a) sais minerais
Se uma planta no solo precisa para
crescer de elementos minerais que são
absorvidos pelas raízes, quanto mais
um explante, que é, por definição, um
pedaço de tecido separado da planta
mãe. E que elementos minerais são
esses? Os estudos da nutrição de plantas provenientes do âmbito da fisiologia vegetal informam que os elementos
que compõem o meio nutritivo da
cultura in vitro devem pertencer à
categoria dos essenciais, isto é, a planta
não se desenvolve na ausência deles.
Existem dois grupos deles: os macronutrientes e os micronutrientes. Entre
os primeiros, podem-se citar: fósforo,
magnésio, nitrogênio etc.; entre os
segundos, boro, manganês, cobre etc.
Os primeiros são adicionados em forma de sal, acima de 100 mg/l até o
máximo de 2.500, como no caso de
KNO3 em B5, enquanto os segundos,
na quantidade de fração de miligramas, uns poucos miligramas por litro
(máximo 27 mg no caso do Fe em
FeSO4. 7H2O). Não sendo o selênio,
rubídio e outros, essenciais para a
planta, não formam parte dos meios
nutritivos mais utilizados: tais como
MS, B5, White, Heller.
Embora a manipulação desses meios constitua um processo de receituário, existe muito fundamento fisiológico na sua utilização; por exemplo,
balanço líquido de cátions e ânions na
solução; antagonismo iônico (o aumento da absorção de um diminui a do
outro); percentagem crítica de um elemento (consumo de luxo); influência
do pH na disponibilidade dos sais para
a planta; absorção diferencial de íons
entre tipos de planta, exemplo: árvores
e gramíneas, estas últimas mais exigentes em bases; transporte ativo de íons
a nível celular; enfim, são conhecimentos que podem auxiliar de modo importante no estabelecimento de um
protocolo de cultura de tecidos para
uma espécie.
b) componentes orgânicos:
Fig.5: Fruto de mamão
(Carica papaya L. cv
tainung 1) mostrando
aspectos e quantidade de
sementes por fruto
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sacarose
Um meio nutritivo também possui
componentes orgânicos, entre eles, sacarose, vitaminas e inositol, para citar
os mais utilizados.
A sacarose é importante como fonte de carbono para alimentar a glicólise
e o ciclo de Krebs, devido a que,
inicialmente, o tecido, explante, não é
suficientemente autotrófico. De um
outro ponto de vista, a sacarose, quando em presença de auxina, pode contribuir para a diferenciação do câmbio
em benefício de novas formações de
xilema e floema. Em alho, altas con-
centrações de sacarose (6%) têm melhorado ostensivamente sua bulbificação.
Sua concentração normalmente varia
entre 1% a 3 %, mas, por efeito da
autoclavagem e do pH, sua concentração no meio pode variar, já que é hidrolizada em glicose e frutose, sendo que
esses limites não são claros e esse problema pode tornar-se limitante para o
explante ou para a planta.
vitaminas
São substâncias requeridas por animais e plantas, embora estas últimas
sejam mais autônomas quanto à sua
Fig.6: Germinação de sementes de mamão sob condições in vitro, após
síntese. As vitaminas são importantes
ter-se retirado a sarcotesta e realizado sua assepsia
fatores catalíticos de rotas metabólicas
na célula. Nos trabalhos pioneiros da
cultura de tecido, os requerimentos de ser encontrado como pertencente ao mentos variam segundo as plantas, senvitaminas foram satisfeitos mediante su- complexo vitamínico B e necessário ao do que, no meio de cultura, as monocoplementos de composição pouco co- crescimento de leveduras e de células tiledôneas são muito sensíveis à sua
nhecidos, como extrato de leveduras, de animais (mamíferos) in vitro.
falta. No MS, o meio mais universalmenleite de côco, hidrolizado de proteínas,
Na área de cultura de tecidos vege- te utilizado, sua prescrição é 100 mg/
extrato de malte, etc. Hoje, apesar de tais, muitos o consideram uma fonte
litro.
essa tendência não haver desaparecido, complementar de carboidrato, mais
o mais freqüente, é que, os meios nutri- que um composto vitamínico, e que
agentes gelificantes
tivos incorporem vitaminas específicas desempenha um papel importante na
São necessários, considerando que o
como B1 (tiamina), B6 (piridoxina), áci- formação de pectinas e hemicelulose
explante e as plantas obtidas devem
do pantotênico, ácido nicotínico, ácido na parede celular. Seu uso data, apro- ficar sobre um suporte, para não afundaascórbico etc.
ximadamente, de 1951, e é decorrente rem. Em geral, os meios sólidos são
Não obstante as plantas sepreferidos aos de cultura líquirem capazes de sintetizar suas
da, sendo que estes últimos são
próprias vitaminas, fica a dúvida
mais caros pelo fato de exigirem
se a incorporação no meio é
um agitador para evitar o afogasempre necessária. Contudo, em
mento ou a hipoxia do explante.
se tratando de drenos, raízes, por
O agente gelificante forma
exemplo, a suposição de que
com a água um gel que funde a
nem todos os seus requerimen100°C e que solidifica por volta
tos nutricionais orgânicos sejam
dos 45°C; não é hidrolizado por
sintetizados ficou evidenciada já
enzimas e, aparentemente, não
em 1930, quando pesquisadores
reage com o resto de ingrediencomo Bonner, Robbins, White
tes do meio.
etc, observaram que, na presença
O ágar-ágar é um tipo de
de algumas vitaminas (tiamina,
agente gelificante de natureza
Fig.7:
piridoxina, ác. nicotínico, etc.), o
polissacarídica produzido por
Prévia assepsia, gema caulinar de abacaxi (Ananas algas (Gelidium amansii), sencrescimento das raízes (tomate,
ervilha e rabanete) melhorava comosus L. Merr. Cv Pérola) cultivada in vitro
do que sua composição em posensivelmente.
lisacarídeo pode variar de 50% a
Com respeito à quantidade a ser do fato de que, em muitos casos, sua
90 %, por isso, a procedência do mesmo
incorporada, ela varia desde fração de incorporação ao meio de cultura pro- é importante. Por outro lado, a autoclamiligramas até 10 miligramas por litro, moveu diferentes eventos: formação
vagem pode hidrolizá-lo se o pH do
podendo ser esterilizada por filtração ou de gemas, crescimento de calos etc.
meio está ácido, fazendo com que perca
autoclavagem.
Convém lembrar que, em algumas plan- firmeza e, dependendo da marca, o
tas, o myo-inositol está conjugado com agente gelificante pode apresentar immyo-inositol
a auxina, sendo essa uma forma de purezas, como cloro, bário, sulfato etc,
Este composto também descrito como estocar ou transportar aquele hormô- que podem afetar o crescimento dos
meso-inositol, é um isômero do inositol nio, ou, conjugado, em alguns tipos de explantes.
o que, apresenta importância biológica, sementes, com o ácido fosfórico, forGelrite (Merck) é um outro tipo de
já que participa da internalização de mando o ácido fítico.
agente gelificante. Produzido pela bacestímulos externos a partir de receptores
A respeito da sua aplicação, a infor- téria Pseudomonas elodea, é usado em
de membrana. Na literatura médica, pode mação disponível é que os requeri- menor quantidade (2,5 g/l); uma vez
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solidificado, é transparente, o
que facilita a observação da
raiz e focos de contaminação.
Com íons, como Ca++ e Mg++,
forma um elo mais firme do
que com cátions monovalentes
(K+ e Na+).
Devem-se ter cuidados porque, às vezes, os agentes gelificantes, incluída a agarose,
podem induzir hiperhidricidade (vitrificação) nos brotos ou
plântulas obtidas. A hiperhidricidade é uma anomalia do tecido, na qual este fica rígido e
quebradiço (glassy shoot), havendo malformação de estômatos na plântula e dificuldade
para enraizar. É um fenômeno
complexo e depende também
de outros fatores como umidade, amônia, citocinina, pH etc.
hormônios
Estes representam o alma mater da
cultura de tecido, porque são eles que
direcionam o processo morfogenético.
Agrupam-se tradicionalmente em 5 grupos: auxinas, citocininas, giberelinas,
etileno e ac. absícico, sendo, os três
primeiros os mais usados na micropropagação. Por exemplo, sob condições
in vitro, uma planta de abacaxi pode ser
clonada através de uma gema axilar, a
qual, é induzida a produzir inúmeros
brotos com citocinina, que, depois de
alongados com giberelinas, podem ser
enraizados com auxina e transferidos
para terra em casa de vegetação.
Quando se fala de hormônios, é sempre oportuno registrar uma diferenciação terminológica importante. Trata-se
dos chamados “reguladores de
crescimento”, que são substâncias que têm ação similar
aos hormônios, porém, têm
origem sintética. Assim, o ácido indol acético (AIA) e o
Picloram são duas auxinas, mas,
enquanto o primeira é hormônio, a segunda é um regulador
de crescimento, que, na prática laboratorial, terminam sendo chamados de hormônios.
Em geral, tanto uns como
outros são usados na ordem de
uns poucos µM até 40 µM. No caso do
meio ter carvão ativado, pode-se aumentar a concentração em até 100 µM.
Por outro lado, as auxinas e giberelinas
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tidas em freezer ou refrigerador.
Fatores ambientais:
Fig.8: Plântula de abacaxi
oriunda de uma gema caulinar.
Por micropropagação milhares
dessas plântulas (clones)
podem ser obtidas
podem ser dissolvidas em NaHO (0,1 1 N) e as citocininas em HCl também na
faixa de 0,1 - 1 N. Em doses maiores
produzem efeitos tóxicos ou teratológicos ou ainda inibirem a fotosíntese,
como é o caso da auxina sintética 2,4D ( ácido 2,4-diclorofenoxiacético).
No caso de seu uso em quantidades
pequenas, é aconselhável obtê-los de
soluções estoques que devem ser man-
Fig.9: Embriões somáticos
de café, obtidos a partir de
explantes foliares de cv Rubi
luz
Luz e temperatura são dois
fatores importantes nas salas de
cultura, onde devem ser controlados para que as plantas ali
mantidas se desenvolvam adequadamente. São raras as salas
de cultura com iluminação constante.
A luz é importante para a
planta sob três pontos de vista.
Do ponto de vista da fotossíntesse, da fotomorfogênese e do
fototropismo; por isso, a sua
inclusão numa sala de cultura.
Nessa sala, a luz deve seguir um
determinado fotoperíodo, por
exemplo, 16 h luz e 8 de escuro, sendo
que, nas prateleiras a irradiância (densidade de fluxo radiante por superfície, W
m-2, ou densidade de fluxo de fótons,
µmol m-2 s-1)1 pode variar de 8 a 15 W m2
. Embora nas salas seja usada luz branca
fluorescente, a composição espectral pode
variar conforme as marcas comerciais
oferecidas. Algumas podem apresentar
mais irradiação na região do azul / violeta
(perto de 71 kcal/Einstein ); outras, na
região do laranja / vermelho ( cerca de 43
kcal/Einstein) Essas variações podem representar impactos diferentes na cultura
in vitro, segundo a espécie em questão.
Assim, em alguns casos, uma luz mais
rica em vermelho que azul pode, por
exemplo, estimular melhor a indução de
raízes adventícias. Já em outros
casos, a luz azul pode estimular
mais a brotação de calos que
outros comprimentos de onda,
mas esta também pode contribuir a quebrar a molécula de
AIA.
De modo geral, a luz branca
estimula a indução de brotos,
porém, tende a inibir a indução
de raízes. Entretanto, é bom
lembrar que o nível de irradiância é importante na resposta
morfogenética. Sendo assim,
uma irradiância baixa (3 W m-2)
pode ser mais efetiva que uma
irradiância alta (12 W m-2) na
indução de brotos a partir de
calos, ou vice-versa.
Pode-se contornar o problema de se
obterem maiores ou menores irradiâncias com o número de lâmpadas por pra-
teleira ou determinando que
altura deverá ter a prateleira.
Para a cultura in vitro,
irradiâncias maiores que 15
W m-2 podem reduzir a fotosíntesse das plantas, o que
não necessariamente pode
acontecer em condições de
campo. Irradiâncias maiores na sala de cultura obviamente contribuirão para
elevar a temperatura dos
frascos, embora se saiba que,
em café, irradiâncias altas
não reduziram a fotosíntesse quando a temperatura
foliar permaneceu constante a 25 °C.
temperatura
Em geral, nas salas de cultura, a
temperatura a ser usada varia entre 24º
e 27°C. É importantíssimo contar com
um sistema de refrigeração acionado
por termostato para manter fixa a temperatura. O fato de os reatores das
lâmpadas ficarem fora da sala de cultura, ajuda, ou senão, o uso de reatores
eletrônicos, que não esquentem. Mesmo com todas as precauções de manter
as variações de temperatura sob controle, sempre temos nas placas ou
tubos de ensaios problemas de condensação da água nas paredes desses
materiais. Existem câmaras ou incubadoras que evitam esse problema, mas
seu preço é “proibitivo”. Com respeito
às necessidades eventuais de temperaturas alternadas entre o dia e a noite, é
preferível usar incubadoras para lograr
isso.
02 e C02
Existe pouca informação sobre o
microclima gasoso dentro do tubo de
ensaio. De qualquer maneira, a presença deles é importante para a respiração do explante ou para a fotossíntesse da plântula. No que diz respeito
à respiração aeróbica-(glicólise + ciclo
de Kreb), considerando apenas um
tecido heterotrófico, e em se tratando
de tubos de ensaio, podemos supor
que, no volume disponível acima do
meio sólido, existe, inicialmente, uma
concentração e uma pressão parcial do
02 equivalente à atmosférica (25 °C e 1
atmosfera); isso é:, 8,6 mM e 0,2 atmosfera, respectivamente, embora esse
valor, no decorrer do tempo, possa
Fig.10: Explante foliar de café,
mantido no escuro, insinuando, após 30 dias, formação de
calo pela ação de um regulador de crescimento presente
no meio nutritivo
diminuir no interior do tubo e a
respiração anaeróbica, supostamente, não começará a operar antes da
repicagem seguinte do material. É
provável que, em níveis de 0,3 mM e
0,07 atmosfera de pressão parcial do
02 no espaço interior do tecido (explante, calo etc.) essa respiração rapidamente comece a operar e, com isso,
iniciar-se a morte do explante. Isso
levanta a questão sobre a transferência periódica do material, o volume
do frasco e a permeabilidade ou não
da tampa.
A concentração de C02 de 350 µl /
l no ambiente externo não necessariamente reflete a concentração de C02
no ambiente interno do tubo de ensaio. Muitas vezes ela pode ser maior
no tubo, devido à respiração da plântula no período noturno. Por outro
lado, no caso de uma plântula com
irradiância de 60 µm m-2 s-1 e aquela
quantidade de C02 rapidamente deveria ultrapassar o ponto de compensação. Contudo, parece que essas interações são mais complexas do que
parecem, porque existem evidências
de que a presença de sacarose no
meio pode deprimir a rubisco, reduzir
a fotosíntesse e, conseqüentemente, a
utilização de C02 e, dessa forma, a
plântula não apresentará sinais de
crescimento satisfatório e
provocará reações de desconcerto no observador,
sobre as possíveis causas
de seu não crescimento.
Tentou-se aqui apresentar uma visão sinóptica do
que seja a cultura de tecido
in vitro e sua importância
para a biologia de plantas.
No campo econômico, sem
ir muito longe, basta lembrar que, através dessa técnica, a floricultura movimenta milhões de dólares e
de plantas anualmente.
Na Embrapa /Cenargen
(Brasília DF) usamos essa
técnica em quatro frentes:
na micropropagação , na
criopreservação, na conservação de germoplasma e na transformação, todas elas, visando a uma
agricultura mais moderna e competitiva para o país.
Bibliografia
BARRUETO CID, L.P. (Ed.). Introdução aos hormônios vegetais. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia,2000. 205 p. No prelo.
BARRUETO CID, L.P.; MACHADO, A. C.G.; CARVALHEIRA, S.B.C.;
BRASILEIRO, A.C.M. Plant regeneration from seedling explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla. Plant Cell,
Tissue Organ Culture, v.56:17-23,1999.
BUCHANAN, B.B.; GRUISSEM, W.;
JONES, R.L. Biochemistry & molecular biology of plants. Rockville:
American Society of Plant Physiologist, 2000. 1367 p.
DODDS,J.H.; ROBERTS, L. Experiment in plant tissue culture. London: Cambridge Unv. Press, 1982. 178
p.
FOSKET, D.E. Plant growth and
development. A molecular approach. San Diego: Academic Press, 1994.
580 p.
GEORGE, E.F. Plant propagations by tissue culture. Part 1-2. Edington: Exegetics Ltd, 1993/1996. 1361 p.
PIERIK, R.L.M. In vitro culture of
higher plants. Drodrecht: Martinus
Nijhoff Pub.,1987. 344 p.
REDLIN, S.C.; CARRIS, L.M. Endophytic fungi in grasses and woody
plants. Minnesota: APS Press, 1996.
223 p.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
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