MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
FACULDADE DE AGRONOMIA ELISEU MACIEL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
PROPAGAÇÃO IN VITRO DE PORTA-ENXERTOS DO
GÊNERO Prunus spp.
PAULO SÉRGIO GOMES DA ROCHA
Tese apresentada à Universidade Federal de
Pelotas, sob a orientação da Profa. Dra. Márcia
Wulff Schuch, como parte das exigências do
Programa de Pós-graduação em Agronomia,
Área de Concentração: Fruticultura de Clima
Temperado, para obtenção do título de Doutor
em Ciências (Dr.).
PELOTAS
RIO GRANDE DO SUL – BRASIL
MARÇO DE 2006
ii
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
FACULDADE DE AGRONOMIA ELISEU MACIEL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
PROPAGAÇÃO IN VITRO DE PORTA-ENXERTOS DO
GÊNERO Prunus spp.
PAULO SÉRGIO GOMES DA ROCHA
Tese apresentada à Universidade Federal de
Pelotas, sob a orientação da Profa. Dra. Márcia
Wulff Schuch, como parte das exigências do
Programa de Pós-graduação em Agronomia,
Área de Concentração: Fruticultura de Clima
Temperado, para obtenção do título de Doutor
em Ciências (Dr.).
PELOTAS
RIO GRANDE DO SUL – BRASIL
MARÇO DE 2006
ii
iii
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
FACULDADE DE AGRONOMIA ELISEU MACIEL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
PROPAGAÇÃO IN VITRO DE PORTA-ENXERTOS DO
GÊNERO Prunus spp.
PAULO SÉRGIO GOMES DA ROCHA
TESE
Submetida como parte dos requisitos para obtenção do grau de
DOUTOR EM CIÊNCIAS
Programa de Pós-graduação em Agronomia
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel
Pelotas – RS, Brasil
Comitê de Orientação:
Profª. Drª. Márcia Wulff Schuch – Orientadora - FAEM/UFPel
Prof. Dr. Valmor João Bianchi – Co-orientador - IB/UFPel
Homologada em: ______/______/ 2006
Comissão Julgadora:
Profª. Drª. Eugênia Jacira Bolacel Braga – IB/UFPel
Prof. Dr. Valmor João Bianchi – IB/UFPel
Prof. Dr. Valdecir Carlos Ferri – FAEM/UFPel
Prof. Dr. Leo Rufato – UDESC
Profª. Drª. Andrea De Rossi – FAEM/UFPel (Suplente)
iii
iv
PAULO SÉRGIO GOMES DA ROCHA
PROPAGAÇÃO IN VITRO DE PORTA-ENXERTOS DO
GÊNERO Prunus spp.
TESE
Submetida como parte dos requisitos para obtenção do grau de
DOUTOR EM CIÊNCIAS
Programa de Pós-graduação em Agronomia
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel
Pelotas – RS, Brasil
APROVADA EM: 21 de fevereiro de 2006.
Por:
Homologada em: ____/____/ 2006
Prof. Dr. Leo Rufato
Profª. Dra. Andrea De Rossi
Prof. Dr. Valdecir Carlos Ferri
Prof. Dr. Valmor João Bianchi
(Co-orientador)
Profª. Drª. Márcia Wulff Schuch
(Orientadora)
iv
v
Dados de catalogação na fonte:
(Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)
Biblioteca de Ciências Agrárias
R672p Rocha, Paulo Sérgio Gomes da
Propagação in vitro de porta-enxertos do
gênero Prunus spp. / Paulo Sérgio Gomes da
Rocha ; orientadora Márcia Wulff Schuch. –
Pelotas, 2006. –101 f.: il.
Tese (Doutorado). Fruticultura de Clima
Temperado. Faculdade de Agronomia Eliseu
Maciel. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas,
2006.
1. Pessegueiro 2. Qualidade de luz 3. Cultura
de tecido 4. Porta-enxertos I .Schuch, Márcia
Wulff (orientadora) II. Título.
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
v
vi
O pessimista se queixa do vento, o otimista espera
que ele mude e o realista ajusta a vela.
(Willian George Ward)
vi
vii
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), pela concessão da bolsa de estudos.
À Universidade Federal de Pelotas, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel,
pela oportunidade de realização do Curso.
À Professora Drª. Márcia Wulff Schuch, pela orientação, conhecimentos
científicos e subsídios para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao professor Dr. Valmor João Bianchi, pela co-orientação, ensinamentos e
estímulo.
À Deus, pela sua presença em todos os momentos.
A minha mãe, por ter me possibilitado uma boa formação acadêmica e
pessoal.
A todos os colegas e amigos do curso de Pós-Graduação com que convivi
durante este período.
A minha namorada Clarice, pelo companheirismo, compreensão e incentivo.
Aos professores da FAEM, pelos conhecimentos científicos durante a
realização do curso.
Finalmente, minha gratidão sincera a todas as pessoas que de forma direta
ou indireta me ajudaram.
vii
viii
ÍNDICE
Página
SUMÁRIO....... ...................................................................................................... xvi
SUMMARY.......................................................................................................... xviii
1- INTRODUÇÃO GERAL....................................................................................... 1
2- CAPÍTULO 1 ....................................................................................................... 4
ESTABELECIMENTO IN VITRO DE DIFERENTES CULTIVARES DE
PORTA-ENXERTO DE Prunus spp. ....................................................... 4
2.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 4
2.2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 9
2.2.1 MATERIAL VEGETAL.............................................................................. 9
2.2.2 Influência da porção do ramo sobre o estabelecimento de
quatro porta-enxertos de Prunus spp.................................................... 10
2.2.3 Efeito do tipo de explante e solidificante no estabelecimento
do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5 ........................................... 11
2.2.4 Qualidade da luz no estabelecimento in vitro do portaenxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5........................................................... 12
2.2.5 Efeito das concentrações de sais do meio de cultura e BAP
no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de pessegueiro
cv. Tsukuba........................................................................................... 13
2.2.6 Efeito da porção do ramo e meio de cultura no
estabelecimento do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio.......................... 14
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 15
2.3.1 Influência da porção do ramo sobre o estabelecimento de
quatro porta-enxertos de Prunus spp.................................................... 15
viii
ix
2.3.2 Efeito do tipo de explante e solidificante no estabelecimento
do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5 ........................................... 18
2.3.3 Qualidade da luz no estabelecimento in vitro do portaenxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5........................................................... 23
2.3.4 Efeito das concentrações de sais do meio de cultura e
BAP no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de
pessegueiro cv. Tsukuba ...................................................................... 26
2.3.5 Efeito da porção do ramo e meio de cultura no
estabelecimento in vitro do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio .............. 29
2.4 CONCLUSÕES ............................................................................................ 31
3- CAPÍTULO 2 ..................................................................................................... 33
MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE DIFERENTES CULTIVARES DE
PORTA-ENXERTO DE Prunus spp. ..................................................... 33
3.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 33
3.2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 38
3.2.1 Diferentes meios e concentrações de BAP na multiplicação
in vitro dos porta-enxertos de Prunus cvs. Sírio e Mr. S. 2/5 ............... 38
3.2.2 Efeito das concentrações de BAP na multiplicação in vitro
dos porta-enxertos de Prunus cv. Tsukuba.......................................... 39
3.2.3 Influência da qualidade da luz e concentrações de BAP na
multiplicação do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5...................... 40
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 42
3.3.1 Diferentes meios e concentrações de BAP na multiplicação
in vitro dos porta-enxertos de Prunus cvs. Sírio e Mr. S. 2/5 ............... 42
3.3.2 Efeito das concentrações de BAP na multiplicação in vitro
dos porta-enxertos de Prunus cv. Tsukuba.......................................... 46
3.3.3 Influência da qualidade da luz e concentrações de BAP na
multiplicação do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5.................... 49
3.4 CONCLUSÕES ............................................................................................ 54
4- CAPÍTULO 3 ..................................................................................................... 55
ENRAIZAMENTO IN VITRO DO PORTA-ENXERTO DE Prunus spp.
cv. Mr. S. 2/5......................................................................................... 55
4.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 55
4.2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 59
4.2.1 Efeito do ágar, vermiculita e sacarose no enraizamento in
vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 .................................................... 59
4.2.2 Qualidade da luz e diferentes concentrações de AIB no
enraizamento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5.......................... 60
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 62
ix
x
4.3.1 Efeito do ágar, vermiculita e sacarose no enraizamento in
vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 .................................................... 62
4.3.2 Qualidade da luz e diferentes concentrações de AIB no
enraizamento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5.......................... 67
4.4 CONCLUSÕES ............................................................................................ 73
5- CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................. 74
6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 75
APÊNDICE............................................................................................................ 87
x
xi
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Página
TABELA 1- Principais características dos porta-enxertos de Prunus.
UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................... 7
TABELA 2- Características dos filtros de luz utilizados. UFPel, PelotasRS, 2006............................................................................................ 8
TABELA 3- Percentagem de estabelecimento in vitro dos explantes
provenientes de duas diferentes porções de ramos de
porta-enxertos de Prunus spp. UFPel, Pelotas-RS, 2006................ 16
TABELA 4- Percentagem de estabelecimento dos explantes da cv. Mr.
S. 2/5 ao final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel,
Pelotas-RS, 2006............................................................................. 19
TABELA 5-
Percentagem de oxidação dos explantes da cv. Mr. S. 2/5
ao final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS,
2006................................................................................................. 20
TABELA 6- Percentagem de vitrificação dos explantes de Mr. S. 2/5 ao
final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006 ........... 21
TABELA 7 - Comprimento médio das brotações (mm) e número médio
de folhas em brotações da cv. Mr. S. 2/5 formadas a partir
de gema e segmento nodal ao final de 30 dias de cultivo,
em função do agente solidificante. UFPel, Pelotas-RS,
2006................................................................................................. 22
xi
xii
TABELA 8- Efeito de diferentes tipos de filtros sobre o comprimento
médio das brotações (mm), número de gemas e número
de folhas das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5,
aos 35 dias de estabelecimento. UFPel, Pelotas-RS, 2006 ............ 25
TABELA 9-
Percentagens de
contaminação, estabelecimento
e
comprimento médio das brotações observados aos 30 dias
de cultivo na fase de estabelecimento in vitro do portaenxerto cv. Tsukuba, em função do meio de cultura.
UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................. 26
TABELA 10- Percentagem de
estabelecimento dos
explantes
provenientes de duas diferentes regiões dos ramos do
porta-enxerto de Prunus cv. Sírio. UFPel, Pelotas-RS,
2006................................................................................................. 29
CAPÍTULO 2
TABELA 1- Percentagem de brotações e número médio de brotações
formadas ao final de 30 dias de cultivo in vitro, em função
do meio de cultura . UFPel, Pelotas-RS, 2006 ................................ 43
TABELA 2- Comprimento médio das brotações dos porta-enxertos cvs.
Mr. S. 2/5 e Sírio formadas ao final de 30 dias de cultivo
em meio MS e QL. UFPel, Pelotas-RS, 2006.................................. 45
TABELA 3- Percentagem de brotação e número médio de brotações
formadas a partir de ápice caulinar e segmento nodal
isolado do porta-enxerto Tsukuba, aos final de 28 dias de
cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006 ........................................ 46
CAPÍTULO 3
TABELA 1- Percentagem de enraizamento e número de raízes
formadas pelas brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5
em meio MS acrescido de ágar ou vermiculita. UFPel,
Pelotas-RS, 2006............................................................................. 63
xii
xiii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Página
FIGURA 1- Brotações da cv. Mr. S. 2/5 estabelecidas em meio líquido
(1), phytagel (2) e ágar (3) a partir de segmento nodal
(esquerda) e gema (direita), ao final de 30 dias de cultivo.
UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................. 23
FIGURA 2- Aspecto das brotações do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5,
provenientes do cultivo em meio MS e diferentes filtros de
luz: SF (sem filtro); verde (nº 088 Lime green), azul (nº
115 Jas blue), azul (nº 724 Ocean blue) e verde (nº 738
Jas green). Pelotas-RS, 2006.......................................................... 25
FIGURA 3- Aspecto da brotação do porta-enxerto de Prunus cv.
Tsukuba estabelecida in vitro, ainda ligado ao segmento
nodal da planta matriz, aos 30 dias de cultivo. UFPel,
Pelotas-RS, 2006............................................................................. 27
FIGURA 4- Comprimento médio das brotações do porta-enxerto cv.
Tsukuba, aos 30 dias de cultivo in vitro em diferentes
concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006. ......................... 28
xiii
xiv
CAPÍTULO 2
FIGURA 1- Número médio de brotações formadas ao final de 30 dias,
pelos porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio, cultivados em
diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS,
2006................................................................................................. 44
FIGURA 2- Aspectos das brotações do porta-enxerto Tsukuba
proveniente da fase de multiplicação, formadas a partir do
segmento nodal (A) e ápice caulinar (B). UFPel, PelotasRS, 2006.......................................................................................... 47
FIGURA 3- Comprimento médio das brotações (mm), a partir de ápice
caulinar do porta-enxerto cv. Tsukuba, cultivadas em meio
MS acrescido de diferentes concentrações de BAP, aos
final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS,
2006................................................................................................. 48
FIGURA 4-
Número médio das brotações formadas do porta-enxerto
cv. Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes
concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006. ......................... 50
FIGURA 5- Brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 proveniente da
fase de multiplicação, em meio de cultura acrescido de
0,5; 1,0; e 2,0 mg L-1 de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006................. 50
FIGURA 6- Comprimento médio das brotações formadas pelo portaenxerto cv. Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por
diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS,
2006................................................................................................. 51
FIGURA 7- Número médio de folhas formadas por brotações do portaenxerto cv. Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por
diferentes concentrações de BAP e diferentes qualidades
de luz. UFPel, Pelotas-RS, 2006. .................................................... 53
CAPÍTULO 3
FIGURA 1- Percentagem de enraizamento do porta-enxerto cv. Mr.S.
2/5 cultivado no meio MS, com diferentes concentrações
de sacarose. UFPel, Pelotas-RS, 2006 ........................................... 64
FIGURA 2- Número médio de raízes formadas das brotações do portaenxerto cv. Mr.S. 2/5 provenientes do cultivo em meio MS
com diferentes concentrações de sacarose. UFPel,
Pelotas-RS, 2006............................................................................. 65
xiv
xv
FIGURA 3- Comprimento médio de raízes formadas pelo porta-enxerto
cv. Mr.S. 2/5 cultivado no meio MS, acrescido de
vermiculita ou ágar, em diferentes concentrações de
sacarose. UFPel, Pelotas-RS, 2006. ............................................... 66
FIGURA 4- Brotações de Mr.S. 2/5 provenientes do cultivo em meio de
cultura MS com ágar ou vermiculita (esquerda/direita).
UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................. 67
FIGURA 5- Percentagem de enraizamento in vitro das brotações do cv.
Mr. S. 2/5, cultivadas em meio MS acrescido de diferentes
concentrações de AIB. UFPel, Pelotas-RS, 2006............................ 68
FIGURA 6- Número médio de raízes formadas por brotações do cv. Mr.
S. 2/5, em meio MS acrescido de diferentes concentrações
de AIB e cultivadas sob diferentes filtros de luz. UFPel,
Pelotas-RS, 2006............................................................................. 70
FIGURA 7- Comprimento médio das raízes das brotações do cv. Mr. S.
2/5, cultivadas em meio MS acrescido de diferentes
concentrações de AIB. UFPel, Pelotas-RS, 2006............................ 71
FIGURA 8-
Aspecto das brotações enraizadas do porta-enxerto cv.
Mr.S. 2/5, provenientes do cultivo em meio MS acrescido
por diferentes concentrações de AIB e cultivadas sob luz
branca. UFPel, Pelotas-RS, 2006.................................................... 72
xv
xvi
SUMÁRIO
ROCHA, PAULO SÉRGIO GOMES DA, Universidade Federal de Pelotas, março
de 2006. Propagação in vitro de porta-enxertos do Gênero Prunus spp.
Orientadora: Drª. Márcia Wulff Schuch. Co-orientador: Dr. Valmor João Bianchi.
Na cultura do pessegueiro, a implantação de um sistema moderno e tecnificado
de produção de mudas é determinante para a obtenção de frutos de qualidade e
uma alta produtividade. Desta forma, a qualidade genética e sanitária do material
propagativo é imprescindível para alcançar o sucesso no empreendimento
agrícola. Com o objetivo de adequar uma metodologia de propagação e de
redução dos custos para a produção de mudas, foram desenvolvidos uma série de
experimentos com porta-enxertos de Prunus spp. nas fases de estabelecimento,
multiplicação e enraizamento in vitro. Os experimentos foram realizados na
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel durante o período de 2003 a 2005. Para a
fase de estabelecimento foram utilizados os porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5, Sírio,
Tsukuba, Nemaguard, Nemared e Flordaguard. Nesta fase foram testados os tipos
de explantes, solidificantes do meio de cultura, qualidade da luz através da
utilização de filtros, efeito da localização da gema no ramo, tipos de meio de
cultura e diferentes concentrações de BAP. Na segunda fase, a de multiplicação,
para os porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5, Sírio e Tsukuba, avaliou-se a qualidade da
xvi
xvii
luz, diferentes concentrações de BAP, tipos de explantes e meios de cultura. Na
terceira, a de enraizamento in vitro, avaliou-se a qualidade da luz, a vermiculita
como substituto do ágar no meio de cultura, diferentes concentrações de sacarose
e AIB no enraizamento do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5. Na fase de
estabelecimento observou-se que o melhor tipo de explante é o segmento nodal e
o ágar foi o melhor solidificante, pois, o phytagel causou vitrificação. Em relação à
qualidade da luz, o filtro verde nº 088 favoreceu a morfogênese das brotações do
porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. A melhor região no ramo para a coleta dos explantes
pode variar de acordo com o porta-enxerto. Na fase de multiplicação verificou-se
que a qualidade da luz não influenciou a formação das brotações. Não houve
formação de brotações adventícias no porta-enxerto cv . Tsukuba cultivado no
meio acrescido de até 1,2 mg L-1 de BAP. Dos explantes testados na cv . Tsukuba,
aquele contendo o ápice proporcionou o maior crescimento dos explantes. O meio
de cultura MS foi o que apresentou os melhores resultados na multiplicação. Para
a fase de enraizamento verificou-se que a adição de sacarose no meio de cultura
é imprescindível e que a vermiculita pode substituir o ágar no meio. Os filtros
utilizados para modificar as condições de luz não contribuíram para aumentar o
percentual de enraizamento in vitro das brotações da cv. Mr. S. 2/5.
xvii
xviii
SUMMARY
ROCHA, PAULO SÉRGIO GOMES DA, Universidade Federal de Pelotas, March
2006. In vitro propagation of Prunus spp. rootstocks. Adviser: Drª. Márcia Wulff
Schuch. Co-adviser: Dr. Valmor João Bianchi.
To obtain peach plants that produce fruits of high quality and to obtain high
productivity, it is necessary a modern and tecnified nursery plant production. The
objective for this study was to establish an appropriated and low cost methodology
for production of nursery Prunus plants. The experiments were carried out at the
“Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel – Universidade Federal de Pelotas” during
the period from 2003 to 2005. For the in vitro establishment phase were used
explants of peach rootstocks cvs. Mr. S. 2/5, Sírio, Tsukuba, Nemaguard, Nemared
and Flordaguard. The variables evaluated on the establishment phase were: type
of explant; culture medium solidifiers; light quality; bud location; type of culture
medium; and different BAP concentrations in the media culture. Regarding to the in
vitro multiplication phase, the peach rootstocks cultivars tested were: Mr. S. 2/5;
Sírio; and Tsukuba, which were evaluated about the effects of the following
variables: light quality; BAP concentrations; type of explant; and type of culture
medium. Regarding to the in vitro rooting phase, the peach rootstock tested was
the cv. Mr. S. 2/5, which was evaluated about the following variables: light quality;
vermiculite as a substitute of agar in culture media; and sucrose and AIB
xviii
xix
concentrations in culture medium. In the phase of in vitro establishment it was
observed that: in general the best explant was nodal segment; the best culture
medium solidifier was agar; the culture medium solidifier phytagel caused explants
vitrification; and the nº 088 green filter for light promoted shoot morfogenesis on
rootstock cv. Mr. S. 2/5. On the in vitro multiplication phase it was observed that:
light quality had no effect on sprouting; addition of BAP 1,2 mg L-1 to the culture
media had no effect on adventitious shooting in the Tsukuba rootstocks; the
sprouts from shoot tip explants had more growth; and the MS culture medium gave
the best results. On the in vitro rooting phase it was observed that: sucrose was
essential for in vitro rooting; vermiculite substituted for agar in medium without
affecting in vitro rooting; and the different light filters did not increase the
percentage of in vitro shoot rooting on the cv. Mr. S. 2/5.
xix
1
1- INTRODUÇÃO GERAL
O Pessegueiro [Prunus persica (L.) Batsch], cultura originária da China e
pertencente à família Rosaceae, é uma das principais frutíferas de clima
temperado cultivadas na região Sul do Brasil, perdendo em área plantada apenas
para a videira e o citros (IBGE, 2005; Tofanelli et al., 2002).
Segundo dados do IBGE (2005), a área plantada com pessegueiro no
Brasil, nos últimos quatro anos, tem expandido em média 4% ao ano. Acredita-se
que, em nível comercial, se houvesse disponibilidade de mudas de pessegueiro
com qualidade genética, fitossanitária e fitotécnica, possivelmente ocorreria
elevação da produtividade.
A forma de propagação do pessegueiro na região Sul do país é,
tradicionalmente, realizada através da enxertia de borbulhas sobre os portaenxertos obtidos a partir de sementes provenientes de fábricas de conservas, as
quais não possuem garantia de qualidade genética e sanitária (Tofanelli et al.,
2001). Essa prática, possivelmente vem ocorrendo ao longo dos anos porque tem
como vantagem a facilidade de se obter caroços nas várias fábricas de conservas
de pêssego da região Sul do Estado do RS.
2
Entretanto, esse método de propagação de porta-enxerto apresenta
algumas desvantagens, entre as mais importantes, pode-se destacar a
segregação genética, a qual poderá ocasionar perdas de características
agronômicas desejáveis, desuniformidade das plantas no pomar e morte precoce
das plantas (Fachinello, 2000; Tofanelli et al., 2003).
Sendo assim, a propagação do pessegueiro por meio de estacas, tanto
para as cultivares de porta-enxerto quanto para as cultivares copa, é apontada por
alguns autores (Dutra et al., 2002; Miranda et al., 2003) como uma prática
promissora para a produção de mudas homogêneas, com baixo custo, rapidez no
processo de produção de mudas e manutenção das características agronômicas
importantes. Entretanto, mesmo sendo a produção de mudas por estaquia um
método bastante interessante, apresenta entraves e não tem sido uma alternativa
viável para a maioria das cultivares de importância econômica, devido ao baixo
percentual de enraizamento (Chalfun & Hoffmann, 1997; Rufato & Kersten, 2000).
Embora sejam utilizadas algumas técnicas, tais como o uso de reguladores
de crescimento (ácido indolbutírico - AIB), visando potencializar este método de
propagação e maximizar o percentual de estacas enraizadas, os resultados
obtidos não têm sido satisfatórios (Tofanelli et al., 2002).
Diante deste contexto, faz-se necessário buscar técnicas mais eficientes
para a produção de porta-enxertos. A técnica de cultura de tecidos tem ocupado
uma posição de destaque e se mostrado como uma alternativa viável de clonagem
de espécies lenhosas, para a formação de pomares clonais ou produção comercial
de mudas (Assis & Teixeira, 1998).
A qualidade genética e sanitária da muda são consideradas características
de fundamental importância para o sucesso da implantação de um pomar
comercial, uma vez que a fruticultura moderna está baseada em pomares
produtivos e o sucesso do empreendimento depende também da utilização de
mudas de qualidade (Fachinello, 2000).
3
Todavia, a possível substituição dos métodos tradicionais de produção dos
porta-enxertos de Prunus pela micropropagação requer que se tenha um domínio
da técnica de cultura de tecidos voltado para as cultivares de importância
econômica, para que possibilite a disponibilização do material propagado em
grande quantidade, principalmente para aos produtores de pessegueiro da região
Sul do Brasil.
A utilização da micropropagação para produção de mudas em escala
comercial visando atender as necessidades internas é uma realidade em alguns
países (Silva, 2004), principalmente em países da Europa, mais especificamente
na Itália onde boa parte da produção dos porta-enxertos é realizada por este
método de propagação (Loreti & Massai, 1995).
No Brasil, os trabalhos de micropropagação de cultivares de porta-enxerto
do gênero Prunus, especialmente para o pessegueiro, são relativamente
escassos. Recentemente, alguns autores demonstraram as dificuldades de
estabelecer in vitro os explantes (Rodrigues et al., 1999) e em multiplicar as
brotações estabelecidas dos porta-enxertos (Silveira et al., 2001).
O objetivo deste trabalho foi identificar nas fases de estabelecimento,
multiplicação e enraizamento o melhor meio de cultura, concentração de BAP, tipo
de explante, concentração de AIB e qualidade da luz para a propagação in vitro de
diferentes cultivares de porta-enxertos de pessegueiro.
4
2- CAPÍTULO 1
ESTABELECIMENTO IN VITRO DE DIFERENTES CULTIVARES DE PORTAENXERTO DE Prunus spp.
2.1 INTRODUÇÃO
Em linhas gerais, o estabelecimento é uma das fases da micropropagação
que tem como objetivo estabelecer in vitro os explantes para os subseqüentes
experimentos de multiplicação e enraizamento.
Um dos principais problemas desta fase de cultivo é a contaminação dos
explantes por diversos organismos (fungos, bactérias e vírus), principalmente as
contaminações causadas por fungos e bactérias endógenas, que sendo de
crescimento lento, se difundem sobre os explantes após o material estar
estabelecido ou em fase de multiplicação (Couto et al., 2004; Mroginski et al.,
2002).
Outro fator que pode dificultar a fase de estabelecimento é a oxidação dos
explantes, ou seja, a liberação dos compostos fenólicos no meio de cultura,
através das células lesionadas pelo corte (Rodrigues et al., 1999). Em alguns
casos, além do escurecimento provocado no meio de cultura, tais compostos
5
podem causar toxidez, inibir o crescimento e ocasionar a morte do explante
(Grattapaglia & Machado, 1998). Algumas técnicas podem ser utilizadas
eficientemente no controle da oxidação, entre estas se destaca o uso de
substâncias anti-oxidantes como ácido ascórbico, carvão ativado, formulação de
meio de cultura mais diluído e o cultivo dos explantes no escuro por um período
máximo de uma semana. Entretanto, o uso de carvão ativado no meio de cultura
poderá dificultar a identificação de contaminação causada por bactéria (Silva,
2004; Rodrigues et al., 2003).
A contaminação dos explantes pode ser evitada ou minimizada através da
manutenção das plantas-matrizes cultivadas em vasos na casa-de-vegetação e a
realização do controle fitossanitário periódico com o uso de agroquímicos (Couto
et al., 2004).
As fontes de contaminações têm como origem a superfície ou o interior do
explante, falhas nos procedimentos de desinfestação e o próprio homem. Deste
modo, a correta identificação da fonte de contaminação e do tipo de
microorganismo são aspectos importantes para efetuar o controle e ter êxito no
estabelecimento; sendo a contaminação causada por fungo mais fácil de ser
controlada (Mroginski et al., 2002; Dantas et al., 2002).
Quanto ao meio de cultura para estabelecimento, de acordo com Andreu &
Marin (2005) podem ser utilizados diferentes tipos. Embora, o meio MS
(Murashige & Skoog, 1962) e suas diluições sejam os mais utilizados na
micropropagação, na fase de estabelecimento das espécies lenhosas os melhores
resultados foram obtidos com meios de culturas diluídos (Silva, 2004).
Ao meio de cultura podem ser adicionados fitorreguladores, visando suprir
as deficiências endógenas dos explantes isolados, estimular a multiplicação ou o
alongamento, mas nem sempre o uso destas substâncias na fase inicial de cultivo
é necessária (Rocha et al., 2004).
Para o estabelecimento in vitro, teoricamente, pode ser utilizado qualquer
tipo de explante da planta, em função da totipotência das células vegetais
(Grattapaglia & Machado, 1998). Mas, na maioria dos trabalhos envolvendo a
micropropagação de frutíferas os explantes escolhidos geralmente são gemas
6
apicais ou axilares (Erig & Fortes, 2002). De acordo com Silva (2004), o tamanho
do explante determina a sua sobrevivência e capacidade de crescimento. Se o
objetivo for somente o de propagar, é mais adequado iniciar o estabelecimento
com ápices ou segmentos caulinares contendo gemas axilares. No entanto, devese considerar que a probabilidade de se isolar propágulos livres de agentes
contaminantes está relacionada com o tamanho do explante utilizado, pois, quanto
menor o explante maior a chance de obter brotações isentas de contaminantes e,
em conseqüência, menor a velocidade no desenvolvimento das mesmas (Torres
et al., 1998).
Os procedimentos de desinfestação, comumente utilizados, consistem em
uma dupla desinfestação mediante a imersão dos explantes em álcool (70% v/v)
durante 10-60 segundos, seguido de hipoclorito de sódio (1,0-2,5%) durante 5-30
minutos, com gotas de tensoativo (Tween-20) para favorecer a quebra da tensão
superficial. Em alguns casos, o hipoclorito de sódio é substituído pelo hipoclorito
de cálcio (6-12%) (Olmos et al., 2002; Mroginski et al., 2002).
Após a desinfestação, alguns patógenos podem permanecer latentes e se
proliferarem quando forem transferidos para um novo meio de cultura. Em geral,
estes patógenos podem ser controlados mediante o emprego de antibióticos
(ampicilina e rifampicina, entre outros) no meio de cultura, no entanto, devem ser
evitados porque alteram a composição do meio (Olmos et al., 2002).
Os explantes devem ser preferencialmente coletados a partir de brotações
novas e a época de coleta dos mesmos, em geral, deve ser realizada durante a
fase de crescimento ativo da planta, ou seja, após o final do período de
dormência, durante os meses mais quentes do ano (Grattapaglia & Machado,
1998). Pois, geralmente os órgãos jovens têm melhor resposta no estabelecimento
do que aqueles obtidos de materiais adultos. Entretanto, o melhor estádio de
desenvolvimento, ou época de coleta dos explantes, deve ser determinado para
cada espécie micropropagada (Willalobos & Torpe, 1991).
Na tabela 1, são
apresentadas as principais características dos porta-enxertos utilizados neste
trabalho.
7
TABELA 1- Principais características dos porta-enxertos
Pelotas-RS, 2006
Porta-enxerto
Flordaguard
Nemaguard
Nemared
Mr. S. 2/5
Sírio
Tsukuba
Origem genética
de Prunus. UFPel,
Propagação
Seleção de Nemaguard
Sementes
USA
Prunus pérsica e P.
Sementes
davidiana - USA
Seleção de Nemaguard
Sementes
USA
Prunus Cerasifera - Itália Estaquia e cultura
de tecidos
P. persica e P.
Estaquia e cultura
amygdalus - Itália
de tecidos
P. persica - Japão
Sementes
Resistência
Meloidogyne
incognita e M.
javanica
M. incognita e
M. arenaria
M. incognita e
M. javanica
Asfixia radicular
M. incognita,
M. javanica e M.
mali
Fonte: Fachinello & Loreti (1995), Loreti (1994).
Em geral, os explantes na fase de estabelecimento são cultivados na
primeira semana em ambiente escuro, com temperatura de 25 + 2ºC, e
posteriormente transferidos para sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas
e densidade de fluxo de 25 µmol m-2 s-1 (Erig & Fortes, 2002; Rodrigues et al.,
1999).
Quanto à fonte de luz utilizada nas salas de crescimento dos laboratórios de
micropropagação, de acordo com Bula et al. (1991), embora as lâmpadas
fluorescentes sejam comumente usadas, este tipo de luz não é mais considerada
como ótima, por possuir e emitir diferentes comprimentos de ondas, sendo que,
atualmente, a melhor fonte de luz são os LEDs (Diodos Emissores de Luz), por
possuírem, dentre outras características, comprimento de onda específico e longo
período de vida útil. Entretanto, devido ao elevado custo, seu uso ainda é restrito.
8
Uma das alternativas utilizadas no estudo da qualidade da luz é a utilização
de filtros de luz, os quais são colocados sobre os frascos contendo os explantes, e
têm contribuído para a obtenção de bons resultados, como exemplo o
alongamento das brotações, número de entrenós e aumento da concentração de
clorofila (Piagnani et al., 2002; Muleo et al., 2001, Baraldi et al., 1988).
A função do filtro de luz é selecionar a transmissão ou bloquear a absorção
de elementos do espectro, emitido a partir de uma fonte de luz.
As principais
características dos filtros de luz utilizados neste trabalho são apresentadas na
tabela 2.
Objetivou-se, neste trabalho, determinar o tipo de explante, posição do
explante no ramo, tipo de meio de cultura, concentração de BAP, solidificante do
meio de cultura e o filtro de luz mais adequado para o estabelecimento in vitro de
diferentes cultivares de porta-enxerto de Prunus spp.
TABELA 2- Características dos filtros de luz utilizados. UFPel, Pelotas-RS, 2006
Tipo de Filtro
Comprimento de onda e Transmissão
Verde Nº 088
520 nm
69%
Azul Nº 115
70%
2%
35%
Azul Nº 724
45%
60%
35%
Verde Nº 738
18%
1%
0%
®
®
Fonte: Lee Filters (2005), Rosco Color Filters (2005).
670 nm
35%
460 nm
2%
9
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micropropagação de
Plantas Frutíferas do Departamento de Fitotecnia da Faculdade de Agronomia
Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas, durante o período de 2003 a
2005.
A fase de estabelecimento in vitro foi subdividida em cinco experimentos
independentes e a metodologia aplicada em cada um segue abaixo.
2.2.1 MATERIAL VEGETAL
Para os experimentos de estabelecimento foram utilizados os portaenxertos de Prunus spp. das cultivares Flordaguard, Nemaguard, Nemared, Mr. S.
2/5, Sírio e Tsukuba.
As plantas-matrizes destes porta-enxertos utilizadas como fonte de explante
foram cultivadas em vasos em casa-de-vegetação e, pulverizadas semanalmente
com Agrimicina® (2,4 g L-1 de Sulfato de estreptomicina) e Cercobin® (0,6 g L-1 de
Tiofanato metil) antes da coleta dos ramos.
10
2.2.2 Influência da porção do ramo sobre o estabelecimento de quatro portaenxertos de Prunus spp.
Este trabalho foi iniciado na segunda quinzena de dezembro de 2003 e teve
por objetivo identificar a melhor porção do ramo para isolamento dos explantes,
visando obter maior percentagem de estabelecimento.
Coletou-se
dos
porta-enxertos
de
Prunus
spp.,
cvs.
Flordaguard,
Nemaguard, Nemared e Mr. S. 2/5, ramos com 30 cm de comprimento, os quais
foram separados em dois grupos. O primeiro grupo foi retirado a partir do ápice do
ramo (0-15 cm – porção apical) e o segundo logo abaixo do ponto do corte (15-30
cm – porção basal).
A desinfestação dos ramos, após a desfolha, foi realizada em câmara de
fluxo laminar com álcool (70%) durante um minuto e hipoclorito de sódio (1,5%)
por 15 minutos, seguido da tríplice lavagem em água destilada autoclavada para
retirada dos resíduos de hipoclorito de sódio. Após a desinfestação, os ramos de
cada grupo (apical e basal) foram seccionados em segmentos nodais com
aproximadamente 10 mm de comprimento, em seguida foram inoculados em tubos
de ensaio com 8 mL de meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962), acrescido
de 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol, 0,75 mg L-1 de BAP, 0,5 mg L1
de GA3, 7,0 g L-1 de ágar e pH 5,8. Após a distribuição do meio de cultura nos
tubos de ensaio, estes foram autoclavados à temperatura de 121 ºC durante 15
minutos.
Depois de inoculado, o material foi mantido durante sete dias em
ambiente escuro com temperatura de 25 + 1 ºC. Após este período, foi transferido
para sala de crescimento com mesma temperatura, fotoperíodo de 16 horas e
luminosidade de 25 µmol m-2 s-1.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em
esquema fatorial 4x2 (cultivar x porção do ramo), com quatro repetições por
tratamento, sendo a unidade experimental, em cada repetição, composta por seis
tubos de ensaio contendo um explante por tubo. As variáveis analisadas ao final
de 30 dias de cultivo foram: percentagem de contaminação bacteriana e fúngica e
percentagem de estabelecimento.
11
2.2.3 Efeito do tipo de explante e solidificante no estabelecimento do portaenxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5
Este trabalho foi iniciado na primeira quinzena de fevereiro de 2004, e teve
como objetivo avaliar o tipo de explante e solidificante. Os ramos coletados da
planta matriz cv. Mr. S. 2/5 foram desinfestados de acordo com a metodologia
descrita no item 2.2.2. Após a desinfestação, foram isolados a partir dos ramos
dois tipos de explantes: segmentos nodais com aproximadamente 10 mm de
comprimento e gemas axilares com tamanho de 5 mm.
Os explantes isolados foram cultivados em tubos de ensaio com 8 mL de
meio de cultura MS, acrescido de 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol,
0,75 mg L-1 de BAP, 0,5 mg L-1 de GA3, 0,05 mg L-1 de AIB e pH 5,8. Para a
solidificação do meio MS utilizou-se 6,5 g L-1 de ágar ou 2,5 g L-1 de phytagel. No
meio MS líquido utilizou-se uma ponte de algodão para suporte do explante.
Após a inoculação dos explantes nos meio de cultura estes foram
cultivados nas mesmas condições descritas no item 2.2.2.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em
esquema fatorial 2x3 (tipo de explante x tipo de solidificante), com quatro
repetições por tratamento, sendo a unidade experimental seis tubos de ensaio
contendo um explante cada.
As variáveis analisadas ao final dos 30 dias de cultivo foram: percentagem
de contaminação bacteriana e fúngica, percentagem de estabelecimento,
percentagem de oxidação, percentagem de vitrificação, comprimento médio das
brotações e número médio de folhas. Considerou-se como estabelecimento os
explantes que não apresentaram nenhuma contaminação e formaram brotação.
12
2.2.4 Qualidade da luz no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de
Prunus cv. Mr. S. 2/5
Este trabalho foi iniciado na primeira quinzena de fevereiro de 2005 e teve
como objetivo avaliar o efeito de diferentes tipos de filtros de luz sobre o
estabelecimento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Os ramos coletados
foram desinfestados conforme a metodologia descrita anteriormente no item 2.2.2,
e depois seccionados em segmentos nodais com uma gema, medindo
aproximadamente 10 mm.
Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio contendo 8 mL de meio
de cultura MS reduzido a ¾ da composição normal dos sais, suplementado com
30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol, 7 g L-1 de ágar e pH 5,2. Em
seguida o material foi colocado em ambiente escuro com temperatura de 25 + 1
ºC, por sete dias. Transcorrido esse tempo, os tubos de ensaio com os explantes
foram transferidos para sala de crescimento com 16 horas de fotoperíodo,
luminosidade de 25 µmol m-2 s-1 e mesma temperatura. Sobre os tubos de ensaio
foram colocadas folhas de filtros da marca Lee Filters (Walworth Ind. Estate,
Andover, England): o filtro verde (nº 088 Lime green) permite, aproximadamente, a
transmissão de 69% da luz verde com comprimento de onda de 520 nm, 35% de
transmissão da luz vermelha com comprimento de onda de 670 nm e 2% de
transmissão da luz azul com comprimento de onda de 460 nm; o filtro azul (nº 115
Jas Blue) permite 35% de transmissão da luz azul, 70% da luz verde e 2% de luz
vermelha; o filtro azul (nº 724 Ocean Blue) permite 35% de transmissão da luz
azul, 45% de luz verde e 60% de luz vermelha; e o filtro verde (nº 738 Jas Green)
permite 18% de transmissão da luz verde, 1% da luz vermelha e 0% da luz azul.
No tratamento controle os tubos de ensaio permaneceram desprovidos da
cobertura, ou seja, sob luz fluorescente.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com
quatro repetições por tratamento, sendo os tratamentos, os tipos de filtros acima
citados, e cada repetição constituída por cinco tubos de ensaio contendo um
explante cada.
13
Após 35 dias de cultivo foram avaliadas as variáveis: percentagem de
contaminação bacteriana e fúngica, percentagem de oxidação, percentagem de
estabelecimento, comprimento médio das brotações, número médio de folhas e
número médio de gemas.
2.2.5 Efeito das concentrações de sais do meio de cultura e BAP no
estabelecimento in vitro do porta-enxerto de pessegueiro cv. Tsukuba
Este trabalho foi iniciado na primeira quinzena de março de 2004, com o
objetivo de identificar o melhor meio de cultura e concentração de BAP.
Segmentos nodais com uma gema e medindo aproximadamente 10 mm,
previamente desinfestados de acordo com a metodologia já descrita no item 2.2.2,
foram colocados em tubos de ensaio com 8 mL de meio de cultura. O meio de
cultura utilizado foi o meio MS com a concentração total dos sais e as reduções
em MS ¾ e MS ½. Os meios de cultura foram suplementados por 0,0; 0,4; 0,8 e
1,2 mg L-1 de BAP, 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol, 7,0 g L-1 de
ágar e pH 5,8. Em seguida o material foi colocado em ambiente escuro com
temperatura de 25 + 1 ºC, por sete dias. Após esse período, os tubos de ensaio
com os explantes foram colocados em sala de crescimento com fotoperíodo de 16
horas, luminosidade de 25 µmol m-2 s-1 e temperatura de 25 + 1 ºC.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em
esquema fatorial 3x4 (meio de cultura x concentração de BAP), com quatro
repetições por tratamento, sendo a unidade experimental seis tubos de ensaio
contendo um explante cada.
Após 30 dias de cultivo, avaliaram-se as percentagens de contaminação
(bacteriana e fúngica), percentagem de estabelecimento e comprimento médio das
brotações.
14
2.2.6 Efeito da porção do ramo e meio de cultura no estabelecimento do
porta-enxerto de Prunus cv. Sírio
Este trabalho foi iniciado na primeira quinzena de dezembro de 2004, e teve
por objetivo identificar a melhor porção do ramo para isolamento dos explantes e o
tipo de meio de cultura, visando obter maior percentagem de estabelecimento.
Após a desinfestação já descrita no item 2.2.2, segmentos nodais com uma
gema e 10 mm de comprimento foram retirados das porções do ramo de 0-15 e
15-30 cm, a partir do ápice. Os explantes foram inoculados em meio de cultura MS
(Murashige & Skoog, 1962), SH (Schenk & Hildebrant, 1972) e WPM (Lloyd &
McCown, 1980). Os meios de cultura foram acrescidos por 30 g L-1 de sacarose,
100 mg L-1 de mio-inositol, 7 g L-1 de ágar e pH 5,8.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em
esquema fatorial 2x3 (porção do ramo x meio de cultura), com quatro repetições
por tratamento, sendo a unidade experimental, em cada repetição, composta por
seis tubos de ensaio com um explante em cada tubo.
Após 35 dias de cultivo, avaliou-se à percentagem de estabelecimento,
percentagem de contaminação (fúngica e bacteriana) e comprimento médio das
brotações.
Considerou-se
como
estabelecimento
os
explantes
que
não
contaminaram e formaram brotação.
Para
análise
estatística,
os
dados
obtidos
nos
experimentos
de
estabelecimento foram submetidos à análise de variância e alguns à análise de
regressão; as médias dos tratamentos foram comparadas estatisticamente pelo
teste de Duncan, através do Programa Estatístico Sanest (Zonta & Machado,
1992). Dados expressos em percentagem foram transformados em arco seno da
raiz quadrada de x/100.
15
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.3.1 Influência da porção do ramo sobre o estabelecimento de quatro portaenxertos de Prunus spp.
Observou-se que os explantes iniciaram a brotação a partir do décimo dia
de cultivo. Esse rápido estabelecimento das brotações provavelmente esteja
relacionado à época de coleta, ou seja, verão, período em que a planta-matriz se
encontrava em ativo crescimento vegetativo. Este resultado está de acordo com
Rodrigues et al. (2003), que compararam o efeito da época de coleta dos
explantes no verão e outono e verificaram que os percentuais de estabelecimento
dos porta-enxertos Marianna e GF 677 foram maiores no verão.
Verificou-se que os segmentos nodais retirados da porção basal dos ramos
do
porta-enxerto
cv.
Nemaguard
apresentaram
uma
percentagem
de
estabelecimento superior aos segmentos obtidos da porção apical da brotação da
planta matriz (Tabela 3). Possivelmente, na época de coleta (período de verão) as
gemas da porção apical do ramo não estavam completamente formadas e, desse
modo,
interferiram
negativamente
na
estabelecimento in vitro dos porta-enxertos.
formação
da
brotação
durante
o
16
De acordo com Villalobos & Thorpe (1991), o estado fisiológico da planta
influencia a capacidade morfogenética, de modo que o requerimento nutricional e
hormonal também é diferente em tecidos provenientes de diferentes idades
fisiológicas da planta. Outro fator importante é a posição relativa da gema.
Bressan et al. (1982) observaram que as gemas axilares de roseiras, obtidas da
parte média do ramo, desenvolveram-se mais rapidamente do que aquelas da
porção apical.
TABELA 3- Percentagem de estabelecimento in vitro dos explantes provenientes
de duas diferentes porções de ramos de porta-enxertos de Prunus
spp. UFPel, Pelotas-RS, 2006
Porta-enxerto
Porção do ramo
Apical (0-15 cm)
Basal (15-30 cm)
Mr. S. 2/5
100,00 aA
98,30 aA
Nemared
63,11 bA
80,55 aA
Flordaguard
19,80 cA
37,29 bA
Nemaguard
2,01 cB
80,54 aA
*Médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem
estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.
Comparando-se o percentual de estabelecimento entre os porta-enxertos
observou-se que a cv. Mr. S. 2/5 apresentou a maior percentagem de brotações
estabelecidas, independente da porção do ramo de onde foram retirados os
segmentos (Tabela 3). Isto ocorreu provavelmente porque a formação e a
maturação das gemas nessa espécie são mais precoces e uniformes, para a
mesma época de coleta dos ramos, em relação às demais cultivares avaliadas,
contribuindo desta forma na maximização do estabelecimento in vitro das
brotações, não havendo interferência da porção do ramo.
17
Os resultados obtidos permitiram inferir que a cv. Mr. S. 2/5 apresenta um
excelente potencial para micropropagação in vitro. Resultados semelhantes aos
obtidos com Mr. S. 2/5 foram observados nas cvs.
Nemared e Nemaguard
quando utilizados os explantes retirados da porção basal do ramo (Tabela 3).
Os explantes da cv. Nemaguard, retirados da região apical, tiveram um
baixo percentual de estabelecimento (2%) quando comparados com os explantes
da porção basal (80%).
A menor percentagem de estabelecimento entre as cultivares foi obtida com
a cv. Flordaguard, fazendo exceção apenas os explantes da cv. Nemaguard
retirado da porção apical (Tabela 3). Nas condições em que se desenvolveu este
experimento, verificou-se que os porta-enxertos estudados possuem diferentes
potenciais para micropropagação. Além disso, a melhor região de coleta do ramo
pode variar para cada porta-enxerto.
A contaminação dos explantes durante a fase de estabelecimento foi baixa,
sendo verificado 1% de contaminação causada por bactéria e 2% causada por
fungo. Estes resultados são inferiores aos obtidos por Rodrigues et al. (2003), que
trabalhando com os porta-enxertos Mirabolano, Okinawa e Nemaguard, coletados
de plantas mantidas no campo, verificaram perdas por contaminação de 76%,
66% e 63%.
O reduzido percentual de contaminação comprova que o método utilizado
neste experimento (plantas mantidas em casa de vegetação e realização de
controle fitossanitário sistemático) é eficiente para obter baixo percentual de
contaminação dos explantes durante a fase de estabelecimento in vitro dos portaenxertos Flordaguard, Mr. S. 2/5, Nemaguard e Nemared. De acordo com
Grattapaglia & Machado (1998), a planta mantida em casa-de-vegetação e/ou
telado permite o maior controle de microorganismos e insetos, além de facilitar a
descontaminação dos explantes.
18
2.3.2 Efeito do tipo de explante e solidificante no estabelecimento do portaenxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5
A contaminação bacteriana e fúngica ocorrida durante os 30 dias da fase de
estabelecimento in vitro foi inferior a 1% e não houve diferença no percentual de
contaminação entre gema e segmento nodal. Os tratamentos fitossanitários das
plantas-matrizes mantidas em casa-de-vegetação, antes da coleta dos explantes,
associados ao processo de desinfestação mostram mais uma vez serem eficientes
no controle da contaminação durante a fase de estabelecimento in vitro de Mr. S.
2/5, evitando perdas de explantes. Silva et al. (2003) trabalhando com os portaenxertos Capdeboscq, GF677 e VP411, obtiveram 18,8% de contaminação dos
ápices caulinares e 29,8% das gemas.
Os segmentos nodais cultivados nos meios solidificados com ágar ou
phytagel apresentaram os maiores percentuais de estabelecimento em relação à
gema, porém não diferiram entre si (Tabela 4). O maior percentual de
estabelecimento
observado
com
o
segmento
nodal
provavelmente
está
relacionado ao tamanho do explante e, conseqüentemente, a maior reserva
existente no material vegetal. Rodrigues et al. (1999), comparando o efeito da
gema e meristema no estabelecimento in vitro dos porta-enxertos cvs. Mirabolano
e Marianna, obtiveram apenas 2,8% de estabelecimento para gemas enquanto
que a partir de meristemas não conseguiram o estabelecimento.
De acordo com Grattapaglia & Machado, (1998), o tamanho do explante
utilizado está relacionado com a possibilidade de sobrevivência e capacidade de
crescimento. Portanto, verifica-se que apesar de serem maiores as possibilidades
de contaminação, os segmentos nodais proporcionaram a maior percentagem de
estabelecimento.
Com relação às gemas, as maiores percentagens de estabelecimento
ocorreram no meio solidificado com phytagel (50,2%) e no meio líquido (31,1%), e
o menor percentual de estabelecimento das gemas foi observado no meio de
cultura
solidificado
com
ágar
(Tabela
4).
Esses
resultados
ocorreram,
principalmente, em função da oxidação das gemas ocorrida nesse último tipo de
meio (Tabela 5).
19
TABELA 4- Percentagem de estabelecimento dos explantes da cv. Mr. S. 2/5 ao
final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006
Tipo de explante
Agente solidificante
Gema
Segmento
Ágar
14,9 bB
99,6 aA
Phytagel
50,2 aB
98,3 aA
Líquido c/ algodão
31,1 aA
50,2 bA
*Médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem
estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.
Verificou-se que, nas condições que o experimento foi conduzido, a
oxidação dos explantes influenciou de forma determinante o percentual de
estabelecimento, principalmente aliado ao tipo de explante. Os maiores
percentuais de oxidação ocorreram nos explantes de menor tamanho, ou seja, nos
explantes tipo gema.
De acordo com Grattapaglia & Machado (1998), quanto menor o explante
maior a possibilidade de ocorrer à oxidação do mesmo. Além disso, a oxidação é
um sério problema em explantes isolados de espécies lenhosas, devido à
liberação de compostos fenólicos pelas células lesionadas. Assim sendo, quanto
mais baixa a relação entre a área do explante e a área da lesão maior vai ser a
quantidade de fenóis produzidos e maiores as possibilidades de falência do
explante. Segundo Rodrigues (2000), os diferentes fenóis presentes nos tecidos,
ao entrarem em contato com o oxigênio, sofrem reações de oxidação, cujos
produtos são tóxicos e causam o escurecimento e necrose do tecido vegetal.
Já, o segmento nodal teve percentuais de morte por oxidação iguais ou
próximos de zero, quando cultivado no meio acrescido com ágar ou phytagel. Mas,
quando cultivado no meio líquido as perdas por oxidação foram de 50,2% (Tabela
5).
20
TABELA 5- Percentagem de oxidação dos explantes da cv. Mr. S. 2/5 ao final de
30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006
Agente solidificante
Tipo de explante
Gema
Segmento
Ágar
85,4 aA
0,0 bB
Phytagel
50,1 bA
0,5 bB
Líquido c/ algodão
68,1 aA
50,2 aA
*Médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem
estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.
A maior percentagem de vitrificação ocorreu com os segmentos nodais
cultivados no meio com phytagel. No meio acrescido de ágar a percentagem de
vitrificação foi nula para as gemas e segmentos nodais (Tabela 6). Resultados
semelhantes foram observados por Leite et al. (1993), que obtiveram, com a
pereira cv. Carrick cultivada em meio MS solidificado com ágar ou gelrite, 0% e
100% de vitrificação, respectivamente.
Possivelmente, essa diferença entre os dois agentes solidificantes, tenha
sido causada porque a utilização de 6,5 g L-1 de ágar no meio disponibilize menos
água para os explantes cultivados do que 2,5 g L-1 de phytagel. De acordo com
Ibrahim (1994) a vitrificação pode ser reduzida a zero com o aumento da
concentração do solidificante no meio de cultura.
Com relação às gemas cultivadas no meio líquido e com solidificante
observou-se que elas tiveram baixos percentuais de vitrificação ou iguais a zero.
De acordo com Zimmerman (1984), a vitrificação ou hiperhidricidade é uma
desordem fisiológica, que geralmente afeta a propagação vegetativa in vitro
ocasionando deformações nas folhas as quais se tornam translúcidas.
21
Além disso, as plantas vitrificadas apresentam baixos níveis de lignina e celulose,
e baixa resistência da parede celular (Cuzzuol et al. 1995). No entanto, a
vitrificação ocorrida nos explantes cultivados em meio semi-sólido pode ser
evitada ou minimizada através do aumento da concentração de ágar ou phytagel
no meio de cultura (Ibrahim, 1994).
TABELA 6- Percentagem de vitrificação dos explantes de Mr. S. 2/5 ao final de
30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006
Tipo de explante
Agente
solidificante
Gema
Ágar
0,0 aA
0,0 cA
Phytagel
0,0 aB
75,1 aA
Líquido c/algodão
0,5 aB
19,8 bA
Segmento
* Médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem
estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.
Para a variável comprimento médio das brotações formadas, explantes
constituidos por segmento nodal atingiram o maior comprimento, com exceção
daqueles cultivados no meio líquido com ponte de algodão (Tabela 7 e Figura 1).
Provavelmente o maior comprimento das brotações originadas destes explantes
esteja relacionada a maior quantidade de reservas nutricionais e hormonais
existentes no tecido vegetal. Entretanto, para os explantes originados de
segmentos nodais, cultivados no meio líquido, o comprimento médio da brotação
não diferiu daqueles originados a partir de gemas. Talvez as reservas de tecidos
do segmento nodal associadas a maior disponibilidade de nutrientes e reguladores
de crescimento proporcionados pelo meio líquido tenham possibilitado uma maior
absorção pelo explante. Possivelmente, esta condição de cultivo ocasionou um
desequilíbrio hormonal e, conseqüentemente, uma paralisação do crescimento.
22
Observou-se que as brotações formadas a partir de segmentos nodais
formaram o maior número de folhas, exceto para os segmentos cultivados no meio
líquido. Talvez a maior disponibilidade de reguladores de crescimento ocorrida no
meio líquido tenha provocado uma inibição no desenvolvimento da brotação e,
conseqüentemente, interferido no número de folhas formadas. O menor número
médio de folhas formadas ocorreu nas brotações formadas a partir de gemas
cultivadas no meio solidificado com ágar.
TABELA 7 - Comprimento médio das brotações (mm) e número médio de folhas
em brotações da cv. Mr. S. 2/5 formadas a partir de gema e
segmento nodal ao final de 30 dias de cultivo, em função do agente
solidificante. UFPel, Pelotas-RS, 2006
Agente solidificante
Comprimento da brotação (mm) (c
Número de folhas
Gema
Segmento
Gema S Segmento
Ágar
2,3 aB
14,1 aA
0,6 bB
7,6 aA
Phytagel
3,1 aB
15,9 aA
3,2 aB
8,6 aA
Líquido c/algodão
3,0 aA
3,4 bA
3,9 aA
2,9 bA
*Médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem
estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.
23
1
2
3
1
2
3
10 mm
FIGURA 1- Brotações da cv. Mr. S. 2/5 estabelecidas em meio líquido (1),
phytagel (2) e ágar (3) a partir de segmento nodal (esquerda) e gema
(direita), ao final de 30 dias de cultivo. UFPel, Pelotas-RS, 2006.
2.3.3 Qualidade da luz no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de
Prunus cv. Mr. S. 2/5
As perdas causadas pela contaminação fúngica (2,0%) e bacteriana (0,0%)
foram
baixas
(dados
não
apresentados).
Estes
resultados
podem
ser
considerados satisfatórios se comparados com os resultados obtidos por
Rodrigues et al. (2003), que trabalhando com os porta-enxertos de pessegueiro,
mantidos no campo, cvs. Mirabolano, Okinawa e Nemaguard, obtiveram perdas
por contaminação superiores a 50%.
O percentual de oxidação obtido neste trabalho (5%) pode ser considerado
alto quando comparado com 1,7% obtido por Rodrigues et al. (2003), que
trabalharam com o porta-enxerto cv. Mirabolano. Os mesmos autores citam que o
uso de substâncias antioxidantes, como ácido ascórbico e polivinilpirrolidona
(PVP), podem favorecer o controle da oxidação dos explantes. Sendo assim, o
percentual de oxidação do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 poderá ser minimizado ou
anulado com a utilização de antioxidantes no meio de cultura.
24
Em relação ao percentual de estabelecimento observado (93%), este é
considerado alto. Resultados similares foram obtidos por Chaves et al. (2004) que,
trabalhando
com diferentes
concentrações de
hipoclorito
de sódio
no
estabelecimento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, obtiveram 96% de
estabelecimento. Esse percentual de estabelecimento possivelmente deve estar
relacionado com a manutenção das plantas-matrizes sob condições controladas
(casa-de-vegetação) e às pulverizações regulares com os defensivos (fungicida e
bactericida).
Para a variável comprimento médio das brotações, verificou-se que os
explantes cultivados sob o filtro verde 088 (nº 088 Lime green) formaram
brotações com comprimento superior às brotações dos demais tratamentos e
visualmente não apresentaram sinais de amarelecimento e/ou vitrificação (Tabela
8 e Figura 2). Esse filtro também contribuiu para a formação de maior número de
gemas e número de folhas. Esses resultados reafirmam as observações feitas por
Silva et al. (1997) de que a qualidade da luz afeta o crescimento e a morfogênese
das brotações cultivadas in vitro.
Observou-se que a morfogênese das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S.
2/5 é influenciada pela qualidade da luz, ou seja, pelo comprimento de onda e a
percentagem de transmissão da luz ocorrida no tipo de filtro utilizado.
O alongamento das brotações cultivadas sob o filtro verde (nº 088 Lime
green) ocorreu devido à reflexão da luz verde transmitida pelo filtro (69%), pois, de
acordo com Salisbury & Ross (1994) a luz verde é refletida pelas plantas.
Possivelmente, a reflexão da luz verde estimulou o alongamento das brotações,
ocasionando efeito semelhante à condição de cultivo no escuro, onde as
brotações estiolam em busca de luz. Contudo, notou-se que visualmente as
brotações deste tratamento não apresentaram aspecto amarelado ou vitrificado.
Esses resultados observados confirmam que o filtro verde (nº 088 Lime green)
permite a transmissão de outros comprimentos de ondas além do verde, como o
vermelho e o azul (35 % e 2% de transmissão, respectivamente) e, possivelmente,
o valor de 35% de luz vermelha transmitida foi suficiente para evitar o
amarelecimento das brotações.
25
TABELA 8- Efeito de diferentes tipos de filtros sobre o comprimento médio das
brotações (mm), número de gemas e número de folhas das
brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, aos 35 dias de
estabelecimento. UFPel, Pelotas-RS, 2006
Tipo de Filtro
Variáveis analisadas
Sem
Filtro
Verde
088
Azul
115
Azul
724
Verde
738
Comprimento da brotação
5,0 b
15,0 a
5,0 b
6,0 b
7,0 b
Número de gemas
2,0 b
4,0 a
2,0 b
2,2 b
2,5 b
Número de folhas
6,0 b
9,0 a
4,0 c
5,0 bc
6,0 b
*Médias seguidas pela mesma letra, na linha, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan
a 5% de probabilidade.
S/F
088
115
724
738
FIGURA 2- Aspecto das brotações do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5, provenientes do
cultivo em meio MS e diferentes filtros de luz: SF (sem filtro); verde
(nº 088 Lime green), azul (nº 115 Jas blue), azul (nº 724 Ocean blue) e
verde (nº 738 Jas green). Pelotas-RS, 2006.
26
2.3.4 Efeito das concentrações de sais do meio de cultura e BAP no
estabelecimento in vitro do porta-enxerto de pessegueiro cv. Tsukuba
Na Tabela 9 pode ser observado que a maior percentagem de
contaminação foi causada por fungo. Os percentuais de contaminação obtidos no
presente trabalho foram inferiores aqueles obtidos por Silva et al. (2003) que
estabeleceram in vitro os porta-enxertos Capdeboscq, GF677 e VP411, e
obtiveram de 14,8% a 29,8% de contaminação. De modo geral, os valores da
contaminação observados neste trabalho podem ser considerados baixos e a
metodologia utilizada eficaz para o estabelecimento do porta-enxerto Tsukuba. Os
resultados obtidos no presente estudo de estabelecimento, somados aos obtidos
por Silva et al. (2003), reforçam a importância de se manter a planta-matriz em
condições controladas (telado ou casa-de-vegetação) e realizar o controle
fitossanitário periodicamente.
TABELA 9-
Tipo de
meio
Percentagens de contaminação, estabelecimento e comprimento
médio das brotações observados aos 30 dias de cultivo na fase de
estabelecimento in vitro do porta-enxerto cv. Tsukuba, em função
do meio de cultura. UFPel, Pelotas-RS, 2006
Contaminação
fúngica (%)
Contaminação
bacteriana (%)
Estabelecimento
(%)
MS
2,13 a
0,35 a
96,67 a
Comprimento
da brotação
(mm)
4,32 a
MS ¾
0,67 a
0,00 a
99,33 a
4,33 a
MS ½
2,94 a
0,00 a
97,09 a
3,67 a
* Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan
ao nível de 5% de probabilidade.
27
Para a variável percentagem de estabelecimento, de acordo com a análise
da variância, não existiu diferença entre os tratamentos utilizados (concentrações
de BAP e tipo de meio de cultura). Possivelmente, a existência de fontes de
reservas no tecido vegetal dos segmentos nodais seja suficiente para a formação
da brotação (Figura 3). Este resultado pode ser considerado satisfatório, pois
representa uma economia significativa, considerando que o BAP é um dos
constituintes mais caros da composição do meio de cultura.
FIGURA 3- Aspecto da brotação do porta-enxerto de Prunus cv. Tsukuba
estabelecida in vitro, ainda ligado ao segmento nodal da plantamatriz, aos 30 dias de cultivo. UFPel, Pelotas-RS, 2006.
As percentagens de estabelecimento obtidas com o porta-enxerto cv.
Tsukuba (Tabela 9), podem ser consideradas elevadas (superior a 96%) se
comparadas com 62,9% obtido por Silva et al. (2003) e 16,67% obtido por
Rodrigues et al. (1999) que trabalharam com os porta-enxertos de Prunus GF 677,
Mirabolano e Marianna. O alto percentual de estabelecimento obtido no presente
trabalho pode estar associado ao período de coleta dos explantes na plantamatriz, pois, na época em que os explantes foram coletados (verão), as plantas
estavam em pleno desenvolvimento.
28
Com relação ao comprimento médio das brotações, verificou-se diferença
significativa para a concentração de BAP utilizada no meio de cultura. Pode-se
observar, por meio da figura 4, um comportamento quadrático do comprimento
médio das brotações com o aumento da concentração de BAP. Em termos
práticos, o BAP não foi significativo para esta variável, já que a diferença entre o
comprimento médio das brotações cultivadas no meio sem BAP e o maior
comprimento médio das brotações cultivadas no meio com BAP (0, 4 mg L-1) foi de
apenas 1,3 mm. Teixeira et al. (2004) que trabalharam com o porta-enxerto cv.
Carelli cultivado em meio de cultura QL acrescido de 0,0; 0,5; e 1,0 mg L.-1 de BAP
e observaram uma inibição do comprimento da brotação ( 16,2; 11,0 e 10,8 mm) à
medida que se elevava a concentração de BAP no meio de cultura. Silva et al.
(2003), trabalhando com o porta-enxerto VP 411, obtiveram brotações com
comprimento médio de 7,5 mm. Isso leva a confirmar
que cada genótipo
responde de maneira diferente as condições de cultivo in vitro.
7
Comprimento médio
da brotação (mm)
6
5
4
3
2
y = -3,478x + 4,21x + 3,53
2
R = 0,91
2
1
0
0.0
0.4
0.8
1.2
-1
Concentração de BAP (mg L )
FIGURA 4- Comprimento médio das brotações do porta-enxerto cv. Tsukuba, aos
30 dias de cultivo in vitro em diferentes concentrações de BAP. UFPel,
Pelotas-RS, 2006.
29
2.3.5 Efeito da porção do ramo e meio de cultura no estabelecimento in vitro
do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio
A maior percentagem de estabelecimento (95%) ocorreu com os explantes
retirados da porção basal do ramo (15-30 cm), em relação aos explantes isolados
da porção de apical (54%) (Tabela 10). Possivelmente, na época em que se
coletou os explantes (verão), as gemas da porção apical do ramo não estavam
completamente formadas e, deste modo, não formaram brotação. Este resultado
reforça a afirmação de que os processos de formação e maturação das gemas
podem ser mais precoces e uniformes, de acordo com o com o material genético
utilizado ou a época de coleta dos ramos. Sendo assim, sugere-se eliminar a
extremidade do ramo do porta-enxerto cv. Sírio em que as gemas estão muito
pequenas ou mal formadas, contribuindo assim para a redução dos custos e maior
eficiência da fase de estabelecimento. Quanto ao tipo de meio de cultura,
observou-se que não houve diferença no percentual de estabelecimento.
TABELA 10- Percentagem de estabelecimento dos explantes provenientes de
duas diferentes regiões dos ramos do porta-enxerto de Prunus cv.
Sírio. UFPel, Pelotas-RS, 2006
Porção do ramo
Percentagem de estabelecimento
Basal (15-30 cm)
95,0 a
Apical (0-15 cm)
54,0 b
*Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan
ao nível de 5% de probabilidade.
30
A percentagem de contaminação dos explantes, avaliada aos 35 dias de
cultivo, foi considerada baixa e não observou-se diferença significativa entre as
porções do ramo utilizadas para coleta dos explantes (0-15 cm e 15-30 cm).
Registrou-se 0,2% de contaminação causada por bactéria e 9% causada por
fungo. Estes resultados são similares aos obtidos por Chaves et al. (2004) que
verificaram 12,5% de contaminação fúngica.
O baixo percentual de contaminação obtido no porta-enxerto de Prunus
reforça que o cultivo das plantas-matrizes em casa-de-vegetação, associado com
o controle fitossanitário sistemático, é eficiente para obtenção do maior percentual
de explantes estabelecidos.
Para a variável comprimento médio das brotações avaliada aos 35 dias de
cultivo, não houve diferença significativa entre os tratamentos utilizados e o
comprimento médio observado foi 6 mm. Silva et al. (2003) que trabalharam com
os porta-enxertos de Prunus cvs. GF 677 e VP 411 obtiveram as brotações com
comprimentos médios de 9,0 mm e 7,5 mm, respectivamente. Esta diferença no
comprimento médio da brotação pode ser atribuída a características de ordem
genética, pois mesmo sendo da mesma espécie, os porta-enxertos de Prunus
podem ter comportamentos in vitro diferentes de acordo com a cultivar. Segundo
Silva et al. (2003), o comprimento da brotação é determinado pelo fator genético,
concentração do regulador de crescimento e tipo de meio de cultura.
31
2.4 CONCLUSÕES
1- Para o porta-enxerto cv. Nemaguard a melhor porção do ramo para coleta do
explante é a basal;
2- É possível obter o estabelecimento das brotações a partir das duas porções de
coleta dos ramos, com exceção da cv. Nemaguard.
3- A melhor forma física do meio é semi-sólido, o ágar é o melhor solidificante e o
segmento nodal é o melhor tipo de explante para o estabelecimento dos
explantes da cv. Mr. S. 2/5;
4- O meio solidificado com phytagel causa vitrificação nas brotações da cv. Mr. S.
2/5.
5- O filtro de luz verde nº 088 favorece a morfogênese e o crescimento das
brotações do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5 durante a fase de estabelecimento.
6- O tipo de meio de cultura e concentração de BAP não influencia o percentual de
estabelecimento dos explantes da cv. Tsukuba.
32
7- A percentagem de estabelecimento do porta-enxerto cv. Sírio é influenciada
pelo local de coleta do explante no ramo, sendo a porção basal do ramo a
melhor para a coleta dos explantes.
8- Os tipos de meios de cultura utilizados não influenciam no percentual de
estabelecimento dos explantes da cv. Sírio.
9- Para os diferentes porta-enxertos BAP não é limitante durante a fase de
estabelecimento, não é necessário utilizar.
33
3- CAPÍTULO 2
MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE DIFERENTES CULTIVARES DE PORTAENXERTO DE Prunus spp.
3.1 INTRODUÇÃO
A micropropagação, ou propagação in vitro, tem sido recomendada como
uma alternativa viável para a propagação de mudas de algumas espécies
frutíferas lenhosas, por possuir como características principais maior rapidez
quando comparada aos métodos tradicionais de propagação, manutenção das
características genéticas e sanidade do material propagado (Couto et al., 2003).
A adoção desta técnica como forma de propagação de porta-enxerto de
macieira, a exemplo das cultivares M-7 (Silveira et al., 2001a) e Marubakaido
(Pereira & Fortes, 2001), tem possibilitado a obtenção de altas taxas de
multiplicação in vitro.
34
Esta técnica, quando aplicada em algumas espécies do gênero Prunus, tem
apresentado alguns problemas durante a fase de multiplicação, devido
principalmente ao baixo desenvolvimento das brotações e à pequena taxa de
multiplicação dos explantes (Rodrigues et al., 2003). Segundo Bennett (1994),
algumas espécies são mais difíceis de multiplicar do que outras, podendo variar
de acordo com o gênero ou a espécie.
Essa diferença de comportamento in vitro entre as duas espécies lenhosas
citadas acima ocorre porque cada espécie e/ou cultivar possuem características
genéticas próprias, deste modo, os explantes cultivados in vitro têm respostas
distintas (Pereira & Fortes, 2001). Sendo assim, é necessária a realização de mais
estudos para que os protocolos de multiplicação tornem-se mais eficientes para
cada espécie (Couto, 2003).
A taxa de multiplicação, número de brotações por explantes, é um
importante fator para determinar a viabilidade da técnica de cultura de tecidos
como um método de propagação massal de determinadas espécies frutíferas.
Entretanto, de acordo com Grattapaglia & Machado (1998), deve-se considerar
que conseguir altas taxas de multiplicação in vitro, pode não ser o ideal se houver
variação de explante para explante. Nesse sentido, o mais desejável é obter uma
taxa de multiplicação satisfatória e que apresente o mínimo de variação.
Para a determinação precisa da taxa de multiplicação in vitro, a
homogeneidade dos explantes no momento inicial de cultivo é de fundamental
importância (Pereira et al., 2005).
Neste sentido, Pereira & Fortes (2001)
verificaram que explantes de origem basal, retirados de brotações estabelecidas
do porta-enxerto de macieira cv. Marubakaido, formaram maior número de
brotações por explante (12,04 brotos) do que os explantes apicais (7,4 brotos).
Resultados semelhantes foram obtidos por San-José et al. (1988), que
trabalhando com explantes apicais e basais de carvalho (Quercus robus),
observaram que os segmentos nodais produziram maior parte aérea do que os
explantes apicais.
35
Uma das formas de aumentar a taxa de multiplicação dos explantes é com
o ajuste do protocolo para cada espécie em estudo. Dentre os fatores mais
importantes para ajustes, destacam-se o tipo de meio de cultura, o tipo e a
concentração de citocinina (Silveira et al., 2001).
Embora um número considerável de porta-enxertos de Prunus spp. seja
multiplicado em meio de cultura MS e suas diluições, quando estes são cultivados
em outros tipos de meio de cultura os resultados da taxa de multiplicação são
similares ou superiores, de acordo com a cultivar ou espécie utilizada (Couto et
al., 2004; Andreu & Marín, 2005; Pérez-Tornero & Burgos, 2000).
Na composição do meio de cultura alguns fatores como tipo e concentração
dos reguladores de crescimento também são considerados importantes para a
obtenção do sucesso na propagação. Assim como o tipo de meio de cultura, a
determinação do tipo e concentração dos reguladores de crescimento também
depende da espécie ou cultivar estudada (Gürel & Gülsen, 1998).
Os reguladores de crescimento atuam estimulando, inibindo ou regulando o
crescimento das plantas (Mercier et al., 1997). O nível endógeno dos reguladores
de crescimento é controlado por vários processos como síntese, hidrólise,
mobilização de reservas e ativação, além da conjunção e degradação com outros
compostos (Moncaleán et al., 2003).
A utilização de uma fonte de citocinina no meio de multiplicação é
indispensável para promover a quebra da dominância apical do explante e induzir
à proliferação de gemas axilares (Pérez-Tornero et al., 2000). Estas duas
respostas promovidas pelas citocininas são resultantes de uma grande variedade
de processos bioquímicos tais como a absorção, distribuição e o metabolismo do
regulador de crescimento (Auer et al., 1992). Desse modo, estes processos
podem afetar a quantidade de citocinina livre no tecido vegetal cultivado. Além
disso, o metabolismo de transformação poderá dar origem a outros compostos
com atividades hormonais diferentes (Moncaleán et al., 2003).
36
Das citocininas utilizadas nos meios de multiplicação, a benzilaminopurina
(BAP) é a que tem contribuído eficientemente na indução de gemas adventícias e
multiplicação dos explantes, além de se destacar das demais por ser mais barata
(Grattapaglia & Machado, 1998).
As concentrações de citocinina (BAP) utilizadas nos meios de multiplicação
dos porta-enxertos de Prunus spp. podem variar de 0,1 à 4,0 mg L-1, de acordo
com a cultivar ou espécie (Couto et al., 2004; Teixeira et al., 2004). Porém, nem
sempre o aumento da concentração de BAP gera aumento do número de brotos
formados, pois, na multiplicação in vitro do porta-enxerto de Prunus spp. cv.
Carelli, observou-se que o número de brotos formados por explante permaneceu
homogêneo (3,3 a 3,4 broto/explante), a partir de 0,5 mg L-1 até 4,0 mg L-1 de
BAP. Notou-se, também, que nas maiores concentrações de BAP houve a
formação de brotos vitrificados (Teixeira et al., 2004). De acordo com Harada &
Murai (1996) e Pérez-Tornero & Burgos (2000), o uso de elevados níveis de BAP
no meio de cultura pode causar desordens fisiológicas como a inibição do
alongamento de folhas e caules, a formação de tufos e a vitrificação dos
explantes.
Alguns meios de multiplicação são acrescidos por outros reguladores de
crescimento, a exemplo das auxinas, visando anular o efeito inibitório do
alongamento causado pelas citocininas. Mas, segundo Silva (2004) a utilização de
uma fonte de auxina (AIA, ANA e AIB) no meio de multiplicação nem sempre é
necessária, devendo ser usada em concentrações menores que 0,5 mg.L-1, pois, o
excesso de um destes reguladores de crescimento pode induzir a formação de
calos ou de raízes indesejáveis nos explantes cultivados.
Embora, a propagação de plantas por meio da cultura de tecidos esteja
baseada na capacidade das citocininas quebrarem a dominância apical e
induzirem a multiplicação, existem estudos relatando que a qualidade da luz
(comprimento de onda) exerce influência na multiplicação e alongamento das
37
brotações,
anatomia
foliar,
formação
e
comprimento
das
raízes
(Soontornchainakaeng et al., 2001; Muleo & Thomas, 1997; Noè & Eccher, 1994).
Assim como, outros estudos relatam a interação dos reguladores de crescimento
com a qualidade da luz (Kraepiel & Maginiac, 1997).
Uma forma significativa de modificar a qualidade da luz nas salas de cultivo
dos laboratórios de micropropagação, as quais são normalmente equipadas com
lâmpadas fluorescentes que emitem luz branca, é através da utilização de filtros
sob a fonte de radiação (Marks & Simpson, 1999).
De acordo com Bula et al. (1991), embora as lâmpadas fluorescentes sejam
comumente utilizadas nas salas de cultivo, esse tipo de fonte de luz não é mais
considerada como ótima por emitir diferentes comprimentos de ondas (350 a 750
nm). Atualmente a melhor fonte de luz são os LEDs, por possuírem comprimentos
de onda específico e longo período de vida útil.
O comprimento de onda da luz é inversamente proporcional à quantidade
de energia, sendo assim, a luz com comprimento de onda curto possui alta
energia. Para a realização da fotossíntese são utilizados fótons com comprimentos
de onda que variam entre 400 e 700 nm, sendo que a luz transmitida na faixa de
500 a 600 nm (luz verde) é refletida pelas folhas (Salisbury & Ross, 1994).
Nos últimos anos, realizaram-se vários trabalhos na área de cultura de
tecidos investigando o efeito da qualidade da luz (Baraldi et al., 1992; Piagnani et
al., 2002; De Rossi et al., 2004). Atualmente, é conhecido que a luz controla várias
etapas do ciclo de vida das plantas. A estrutura e a função de alguns
fotorreceptores estão relativamente bem caracterizadas, principalmente as dos
fotorreceptores que absorvem o vermelho e o vermelho-distante. Entretanto, a
seqüência de eventos que ocorrem após o sinal de percepção da luz, assim como
os mecanismos de tradução do sinal e os efeitos fisiológicos gerados, ainda são
poucos conhecidos (Kraepiel & Maginiac, 1997).
Este trabalho teve como objetivo determinar o melhor meio de cultura,
concentração de BAP, cultivar, tipo de explante e qualidade da luz na
multiplicação dos porta-enxertos de Prunus ssp.
38
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micropropagação de
Plantas Frutíferas do Departamento de Fitotecnia da FAEM, Universidade Federal
de Pelotas, durante o período de 2003 a 2005.
A fase de multiplicação in vitro foi subdividida em três experimentos
independentes e a metodologia aplicada em cada um é apresentada abaixo.
3.2.1 Diferentes meios e concentrações de BAP na multiplicação in vitro dos
porta-enxertos de Prunus cvs. Sírio e Mr. S. 2/5
O objetivo deste trabalho foi determinar o melhor tipo de meio de cultura e
concentração de BAP para a multiplicação in vitro dos porta-enxertos cvs. Mr. S.
2/5 e Sírio.
Foram utilizados segmentos nodais sem o ápice, medindo aproximadamente
5 mm de comprimento, isolados das brotações estabelecidas in vitro, com 30 dias
de cultivo.
Para a inoculação foram utilizados dois meios de cultura, compostos por sais
e vitaminas do meio MS (Murashige & Skoog, 1962) e sais e vitaminas do meio QL
(Quoirin et al., 1977). Ambos os meios de cultura foram acrescidos de diferentes
39
concentrações de benzilaminopurina (0,0; 0,3; 0,6 e 0,9 mg L-1 de BAP), 20 g L-1
de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol e 7 g L-1 de ágar. O pH dos meios foi
ajustado para 5,8 antes da autoclavagem a 121 ºC de temperatura durante 15
minutos.
Os explantes isolados das brotações foram inoculados em frascos com 40
mL de meio de cultura, e após levados para sala de crescimento com temperatura
de 25 + 1 ºC, 16 horas de fotoperíodo e luminosidade de 25 µmol m-2 s-1.
O delineamento experimental adotado foi inteiramente casualizado com um
fatorial 2x2x4, sendo os fatores utilizados: porta-enxerto, meio de cultura e
concentração de BAP, com quatro repetições por tratamento, tendo como unidade
experimental, um frasco contendo cinco explantes. As variáveis analisadas após
30 dias de cultivo foram: percentagem de brotação, número médio de brotações
por explantes e comprimento médio das brotações.
3.2.2 Efeito das concentrações de BAP na multiplicação in vitro dos portaenxertos de Prunus cv. Tsukuba
Objetivou-se neste trabalho determinar qual o tipo de explante e a
concentração de BAP que proporciona os melhores resultados na multiplicação in
vitro. Foram utilizados segmentos da porção apical e da porção basal, com
aproximadamente 7 mm de comprimento retirados de brotações com 35 dias de
cultivo.
Os explantes foram inoculados em frascos com 40 mL de meio de cultura
SH (Schenk & Hildebrandt, 1972), suplementados por 0,0; 0,4; 0,8 e 1,2 mg L-1 de
BAP, 7g L-1 de ágar e pH 5,8. Os frascos com o meio de cultura foram
autoclavados à temperatura de 121 ºC durante 15 minutos.
Após a inoculação, os frascos com os explantes foram transferidos para
sala de crescimento com temperatura de 25 + 1ºC, 16 horas de fotoperíodo e
luminosidade de 25 µmol m-2 s-1, permanecendo nestas condições por 30 dias.
40
O delineamento experimental adotado foi inteiramente casualizado com um
fatorial 2x4 (tipo de explante e concentração de BAP), com quatro repetições por
tratamento, sendo a unidade experimental, um frasco contendo cinco explantes.
Após 30 dias de cultivo, foram avaliadas as variáveis percentagem de
brotação, número médio de brotações e comprimento médio das brotações.
3.2.3 Influência da qualidade da luz e concentrações de BAP na multiplicação
do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5
Este trabalho foi realizado com o objetivou de verificar o efeito da qualidade
da luz e BAP na multiplicação in vitro do cv. Mr. S. 2/5.
Foram utilizados como explantes segmentos caulinares, sem o ápice, com
duas gemas e tamanho aproximado de 7 mm. O meio de cultura utilizado foi o MS
acrescido por 100 mg L-1 de mio-inositol, 30 g L-1 de sacarose, 7 g L-1 de ágar,
suplementado com 0,0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg L-1 de BAP, 0,06 mg L-1 AIB e 0,5 mg L-1
de AG3. O meio de cultura foi distribuído em frascos com capacidade de 250 mL,
sendo que cada frasco recebeu 30 mL. O pH do meio foi ajustado para 5,2 antes
da adição do ágar e em seguida foi autoclavado a 121 oC por 15 minutos.
Após a inoculação, os frascos com explantes foram colocados em sala de
crescimento com 16 horas de fotoperíodo, luminosidade de 25 µmol m-2 s-1 e
temperatura de 25 ºC + 1 ºC. Sobre os frascos foram colocadas folhas de filtros da
marca Lee Filters (Walworth Ind. Estate, Andover, England): o filtro verde (nº 088
Lime green) transmite 69% da luz verde com comprimento de onda de 520 nm,
35% da luz vermelha com comprimento de onda de 670 nm e 2% da luz azul com
comprimento de onda de 460 nm; o filtro azul (nº 118 Light Blue) permite 22% de
transmissão da luz azul, 40% da luz verde e 0% de luz vermelha; e o filtro verde
(nº 738 Jas Green) permite 18% de transmissão da luz verde, 1% da luz vermelha
e 0% da luz azul. No tratamento controle os frascos permaneceram sem
cobertura.
41
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com
um fatorial 4x4 (concentração de BAP e filtro de luz), com quatro repetições por
tratamento, sendo a unidade experimental um frasco com cinco explantes.
Após 35 dias de cultivo, foram avaliados o número médio de brotação,
número médio de folha e comprimento médio da brotação.
Para
análise
estatística,
os
dados
obtidos
nos
experimentos
de
multiplicação foram submetidos à análise de variância e as médias dos
tratamentos comparadas estatisticamente pelo teste de Duncan, ou analisados por
regressão polinomial, através do Programa Estatístico Sanest (Zonta & Machado,
1992). Dados expressos em percentagem foram transformados em arco seno da
raiz quadrada de x /100, e os dados de número médio de brotações por explante e
número médio de folhas foram transformados em raiz quadrada de x+0,5, onde x
é o número obtido.
42
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.3.1 Diferentes meios e concentrações de BAP na multiplicação in vitro dos
porta-enxertos de Prunus cvs. Sírio e Mr. S. 2/5
A maior percentagem de brotação foi obtida com o porta-enxerto cv. Mr. S.
2/5 o qual diferiu significativamente da cv. Sírio (Tabela 1). Nas condições deste
experimento pode-se afirmar que o porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 possui maior
capacidade em formar brotações axilares a partir do segmento nodal, do que o
porta-enxerto cv. Sírio. De acordo com Silva et al. (2003), o genótipo utilizado no
experimento de multiplicação é um dos fatores que exerce influência significativa
na taxa de multiplicação in vitro dos explantes. Os resultados obtidos neste
trabalho estão de acordo com a resposta esperada para cada cultivar, pois o
porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 é uma ameixeira e Sírio um híbrido entre pessegueiro
e amendoeira. A maior facilidade de propagação de espécies de ameixeira já
havia sido relatada em outros trabalhos (Rodrigues et al., 2003; Silveira et al.,
2001).
43
Com relação ao tipo de meio de cultura utilizado para multiplicar os portaenxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio, não se observou diferença significativa para a
percentagem de brotação formada.
Pode ser observado, na Tabela 1, que o porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5
também formou o maior número médio de brotações por explante em relação a cv.
Sírio. O porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 revelou-se superior à cv. Sírio para esta
variável, e o resultado obtido similar ao observado por Silveira et al. (2001), que
obtiveram 1,37 brotações por explante para os segmentos que foram cultivados no
meio MS ¾ e 1,07 brotações para os segmentos cultivados no meio MS. Estes
valores obtidos para a cv. Mr. S. 2/5 são considerados baixos quando comparados
à média de 5,5 brotações por explante, para o porta-enxerto de ameixeira cv.
Julior (Wagner Júnior et al., 2003).
TABELA 1- Percentagem de brotações e número médio de brotações formadas
ao final de 30 dias de cultivo in vitro, em função do meio de cultura .
UFPel, Pelotas-RS, 2006
Porta-enxerto
Percentagem de brotação
Número médio de brotações
Mr. S. 2/5
91,7 a
1,4 a
Sírio
68,6 b
1,0b
* Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem significativamente pelo teste de Duncan
ao nível de 5% de probabilidade.
Observou-se, também, que para esta variável os tipos de meios de cultura
não diferiram entre si. De maneira contrária, Rodrigues et al. (2003), analisando a
influência dos meio MS ¾ e SH em porta-enxertos de Prunus, observaram que o
maior número médio de brotações formadas ocorreu no meio de cultura MS ¾.
Com relação à concentração de BAP para multiplicação dos porta-enxertos
cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio, pode-se observar um comportamento linear na figura 1, e
que a concentração de 0,9 mg.L-1 de BAP foi a que contribuiu para a obtenção do
maior número médio de brotações por explante.
44
Número médio de brotação
1,5
1,4
y = 0,204x + 1,28
2
R = 0,71
1,3
1,2
Sírio
Mr. S. 2/5
y = 0,068x + 1,21
2
R = 0,73
1,1
1
0
0,3
0,6
0,9
-1
Concentração de BAP (mg L )
FIGURA 1- Número médio de brotações formadas ao final de 30 dias, pelos portaenxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio, cultivados em diferentes
concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006.
Com relação ao comprimento médio das brotações, observou-se que o
meio MS foi melhor que o meio QL para os dois porta-enxertos cultivados (Tabela
2). Rodrigues et al. (2003), comparando o efeito do meio MS ¾ e SH, observaram
que o maior crescimento das brotações dos porta-enxertos de Prunus ocorreu no
meio de cultura MS ¾. De acordo com Harada & Murai (1996); Pérez-Tornero et
al. (2000), o comprimento médio das brotações é uma variável determinada por
vários fatores e, dentre estes, destacam-se a concentração e o tipo de regulador
de crescimento, o tipo de meio de cultura e o genótipo.
45
Pode-se observar que o porta-enxerto cv. Sírio apresentou o maior
comprimento médio das brotações, quando cultivado no meio MS. Mas, quando
cultivado no meio QL, este não diferiu significativamente do porta-enxerto cv. Mr.
S. 2/5. Possivelmente, o maior comprimento médio observado nas brotações da
cv. Sírio (12,4 cm) foi influenciado pelo menor número de brotações formadas por
explante deste porta-enxerto e também pelo tipo de meio de cultura (Tabela 2).
TABELA 2- Comprimento médio das brotações dos porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5
e Sírio formadas ao final de 30 dias de cultivo em meio MS e QL.
UFPel, Pelotas-RS, 2006
Tipo de Meio
Comprimento médio da brotação (mm)
MS
Sírio
12,4 aA
Mr. S. 2/5
7,5 bA
QL
5,3 aB
5,8 aB
* Médias seguidas de mesma letra, minúscula na linha e maiúscula na coluna, não diferem
estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.
46
3.3.2 Efeito das concentrações de BAP na multiplicação in vitro dos portaenxertos de Prunus cv. Tsukuba
Para a variável percentagem de brotação formada, de acordo com a análise
da variância, houve diferença significativa entre os tipos de explantes utilizados
para multiplicação do porta-enxerto Tsukuba. Pode-se observar, por meio da
Tabela 3, que o uso de ápices caulinares proporcionou o maior percentual de
brotações em relação ao segmento nodal (Figura 2). Provavelmente, o maior
percentual de brotação observado no explante ápice caulinar esteja relacionado
ao fato de este tipo de explante (ápice meristemático) possuir uma região capaz
de sintetizar citocinina, a qual é responsável pela quebra da dominância apical e
formação da brotação.
TABELA 3- Percentagem de brotação e número médio de brotações formadas a
partir de ápice caulinar e segmento nodal isolado do porta-enxerto
Tsukuba, aos final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS,
2006
Tipo de explante
Ápice caulinar
Segmento nodal
Percentagem de
brotação
99,5 a
Número médio de brotação
3,5 b
1,0 a
1,0 a
*Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan
ao nível de 5% de probabilidade.
47
A
B
FIGURA 2- Aspectos das brotações do porta-enxerto cv. Tsukuba proveniente da
fase de multiplicação, formadas a partir do segmento nodal (A) e ápice
caulinar (B). UFPel, Pelotas-RS, 2006.
Foi observada, nos explantes que brotaram, a formação de uma única
brotação (Tabela 3). Silveira et al. (2001) trabalhando com os porta-enxertos cvs.
GF 677, Marianna, Mr. S. 2/5, Mirabolano e G x N22 cultivados no meio MS ¾,
obtiveram 1,07; 1,53; 1,37; 1,69 e 1,63 broto por explante. Teixeira et al. (2004)
trabalhando com o porta-enxerto cv. Carelli, obtiveram em média 10,4 broto por
explante. Nesse contexto, verifica-se que o número médio de brotos formados por
explante também é dependente de uma característica intrínseca da cultivar
utilizada. Além disso, possivelmente as concentrações de BAP utilizadas não
foram suficientes para quebrar a dominância apical e induzir à formação de
brotações adventícias.
Com relação ao comprimento médio da brotação, observou-se que houve
uma interação significativa entre os fatores concentração de BAP e tipo de
explante. A adição de BAP ao meio de cultura contribuiu para o crescimento das
brotações formadas pelo explante ápice caulinar. Pode-se observar, por meio da
figura 2, que o meio de cultura desprovido de BAP resultou no menor comprimento
das brotações formadas a partir do explante tipo ápice. O comprimento médio das
brotações formadas a partir do explante ápice caulinar foi superior ao do segmento
nodal. Observou-se, também, que as brotações originadas a partir do explante
48
ápice eram mais vigorosas do que as brotações formadas a partir do segmento
nodal, contudo, ambas as brotações apresentaram uma perda de vigor muito
acentuada em relação às brotações da fase de estabelecimento, que
permaneciam ainda ligadas ao segmento retirado da planta matriz.
De modo geral, os comprimentos médios obtidos com os dois tipos de
explantes do porta-enxerto cv. Tsukuba podem ser considerados pequenos.
Silveira et al. (2001), trabalhando com os porta-enxertos GF 677, Marianna, Mr. S.
2/5, Mirabolano e G x N22, cultivaram os explantes com 5,0 mm de comprimento e,
ao final dos 35 dias de cultivo, obtiveram os seguintes comprimentos médios das
brotações 8,0; 9,9; 12,6; 11,6 e 15,1mm.
Comprimento médio das
brotações (mm)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
y = -4,66x2 + 6,71x + 7,3
R2 = 0,84
Ápice
Segmento
nodal
y = -0,925x + 3,5
R2 = 0,75
0.0
0.4
0.8
1.2
-1
Concentração de BAP (mg L )
FIGURA 3- Comprimento médio das brotações (mm), a partir de ápice caulinar do
porta-enxerto cv. Tsukuba, cultivadas em meio MS acrescido de
diferentes concentrações de BAP, aos final de 30 dias de cultivo in
vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006.
49
3.3.3 Influência da qualidade da luz e concentrações de BAP na multiplicação
do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5
Para o número médio de brotações, observou-se diferença significativa para
o fator concentração de BAP. Verificou-se que no meio de cultura sem BAP houve
a formação de uma brotação por explante, com exceção dos explantes cultivados
sob o filtro azul nº 118, os quais não formaram brotação. As concentrações de 1,0
e 2,0 mg L-1 de BAP foram aquelas que promoveram o maior número médio de
brotações (1,6 brotos) (Figura 4), sendo que, nas concentrações de BAP até 1,0
mg L-1 houve formação das brotações a partir das gemas axilares existentes em
cada explante (2 gemas). Entretanto, quando os explantes foram cultivados no
meio de cultura acrescido de 2 mg L-1 de BAP, observou-se a formação de brotos
adventícios, provenientes de regiões sem gemas (Figura 5). Os resultados
verificados mostram que o aumento da concentração de BAP no meio de cultura
induz a formação de brotações adventícias.
Silveira et al. (2001), também investigando o efeito do meio de cultura (MS
e MS ¾) e as diferentes concentrações de BAP (0,1; 0,3; 0,5 e 0,7 mg L-1) com
este mesmo porta-enxerto, obtiveram resultado semelhante, com 0,7 mg.L-1 de
BAP, sendo 1,37 brotos no meio MS ¾ e 1,07 brotos no meio MS. Teixeira et al.
(2004), trabalhando com o porta-enxerto de Prunus spp. cv. Cicarelli em meio de
cultura acrescido por até 4,0 mg L-1 de BAP, obtiveram 3,4 brotos como aumento
da concentração de BAP. Investigando o efeito dos filtros de luz e benziladenina
(BA) no porta-enxerto cv. GF 655-2, Baraldi et al. (1988) observaram que o maior
número médio de brotações (5,5 brotos) ocorreu com os explantes cultivados sem
filtro de luz (tratamento controle), e os explantes cultivados sob filtro azul e filtro
vermelho formaram 2,4 e 3,8 brotos, respectivamente.
Número médio de brotações de
Mr. S. 2/5
50
2
1,8
1,6
1,4
y = -0,262x2 + 0,81x + 1,02
R2 = 0,98
1,2
1
0
0,5
1
1,5
2
-1
Concentração de BAP (mg L )
FIGURA 4- Número médio das brotações formadas do porta-enxerto cv. Mr. S.
2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes concentrações de
BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006.
FIGURA 5- Brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 proveniente da fase de
multiplicação, em meio de cultura acrescido de 0,5; 1,0; e 2,0 mg L-1
de BAP UFPel, Pelotas-RS, 2006.
51
Para o comprimento médio das brotações, observou-se interação entre os
fatores concentrações de BAP e tipos de filtros, entretanto, a regressão não foi
significativa para o filtro verde nº 088 e para o filtro verde nº 738.
Geralmente, o alongamento da brotação é menor/reduzido com o aumento
da concentração de BAP no meio de cultura, isto ocorre porque em alguns casos o
acréscimo de citocinina induz a um aumento do número de brotações formadas
por explante, aumentando a competição por nutrientes. No entanto, o menor
comprimento médio da brotação foi observado (3,6 mm) no meio de cultura sem
BAP (Figura 6). Isto ocorreu, possivelmente, porque não houve um grande número
de brotos formados por explante.
Verificou-se, também, que o aumento da
concentração desta citocinina estimulou o alongamento das brotações. O maior
comprimento médio das brotações (7,1 mm) ocorreu no meio acrescido de 1 mg L1
de BAP, sob a condição de cultivo sem filtro (Figura 6).
Comprimento das brotações
(mm)
8
7
6
5
4
y = -3,06x2 + 8,07x + 0,61
2
R = 0,75
3
2
Filtro 118
Controle
y = 1,42x + 4,56
2
R = 0,6
1
0
0
0,5
1
1,5
2
-1
Concentração de BAP (mg L )
FIGURA 6- Comprimento médio das brotações formadas pelo porta-enxerto cv.
Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes
concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006.
52
Estes resultados são semelhante aqueles obtidos por Wagner Júnior et al.
(2003) que, avaliando o efeito da concentração de BAP na multiplicação in vitro do
porta-enxerto de ameixeira cv. Julior, observaram que o aumento da concentração
de BAP contribuiu para o maior comprimento das brotações. Já Teixeira et al.
(2004) verificaram que o aumento da concentração de BAP (0,0; 0,5; 2,0 e 4,0
mg.L-1) no meio de cultura, inibiu o alongamento, a partir de 0,5 mg L-1, das
brotações do porta-enxerto de Prunus spp. cv. Carelli.
Em relação ao efeito da qualidade da luz no comprimento da brotação, os
resultados obtidos diferem daqueles obtidos por Baraldi et al. (1988) que
avaliaram o efeito da qualidade da luz e concentrações de BA no cultivo do portaenxerto de Prunus spp. cv. GF 655-2, e obtiveram as brotações de maior
comprimento sob o cultivo do filtro vermelho. Esse resultado difere daqueles
obtidos na fase de estabelecimento, em que utilizou-se os mesmos filtros de luz e
porta-enxerto do presente experimento e, no entanto, observou-se que o filtro
verde nº 088 foi aquele que favoreceu o maior comprimento das brotações. Neste
contexto, possivelmente o efeito da qualidade da luz apresente respostas
diferentes de acordo com a fase de cultivo do explante.
Houve interação significativa entre os fatores concentração de BAP e tipo
de filtro para o número médio de folhas. Como já era esperado, o maior número
de folhas ocorreu nas brotações de maior comprimento. Notou-se que o maior
número de folhas ocorreu nas brotações cultivadas na ausência de filtro. Este
resultado difere daqueles obtidos na fase de estabelecimento utilizando os filtros,
em que se observou o maior número de folhas nas brotações cultivadas sob o
filtro verde nº 088. Em relação ao efeito da concentração de BAP, verificou-se um
comportamento linear decrescente para as brotações cultivadas sob os filtros
verde nº 088 e verde nº 738, sendo o maior número de folhas no meio de cultura
sem BAP, com 2,5 e 2,0 folhas, respectivamente. Sob o filtro azul nº 118 e o
tratamento
controle,
observa-se
um
ajustamento
quadrático
para
as
concentrações de BAP, sendo o menor número médio de folhas (0,7 e 1,6 folhas)
obtidas no meio de cultura sem BAP (Figura 7).
53
Embora alguns autores (Sootornchainakaeng et al., 2001) afirmem que a
qualidade da luz contribui para a formação do maior número de folhas, neste
trabalho de multiplicação, não houve a confirmação desta observação.
3
Número médio de
folhas
2,5
2
1,5
1
Verde 088 y = -0,56x + 2,54 R2 = 0,83
― ▪ Azul 118 y = -0,65x2 + 1,61x + 0,85 R2 = 0,63
--- Verde 738 y = -0,28x + 1,92 R2 = 0,83
2
.... Controle y = -0,57x + 1,55x + 1,67
R2 = 0,89
----
0,5
0
0
0,5
1
1,5
2
-1
Concentrações de BAP (mg L )
FIGURA 7- Número médio de folhas formadas por brotações do porta-enxerto cv.
Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes concentrações
de BAP e diferentes qualidades de luz. UFPel, Pelotas-RS, 2006.
54
3.4 CONCLUSÕES
1- O tipo de meio de cultura não influencia na formação do número de brotos por
explante, mas influenciou o comprimento médio das brotações dos portaenxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio;
2- A concentração de 0,9 mg L-1 de BAP induz a maior formação de brotação dos
porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio;
3- O porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 possui maior potencial de multiplicação que a cv.
Sírio.
4- A utilização de BAP no meio de cultura, em concentrações de até 1,2 mg L-1,
não induz a multiplicação dos explantes do porta-enxerto da cv. Tsukuba;
5- O percentual de brotação formada varia de acordo com o tipo de explante
utilizado; o segmento nodal da base da brotação, sem ápice caulinar apresenta
baixo percentual de brotação;
6- Os filtros de luz utilizados não aumentam o número de brotação formada por
explante da cv. Mr. S. 2/5; mas influencia positivamente no número de folhas.
55
4- CAPÍTULO 3
ENRAIZAMENTO IN VITRO DO PORTA-ENXERTOS DE Prunus spp. cv. Mr. S.
2/5
4.1 INTRODUÇÃO
A formação de raízes adventícias nas brotações obtidas por meio da
multiplicação in vitro permite a constituição de plantas completas para posterior
transferência às condições ex vitro (Radmann et al., 2002).
Embora existam brotações que formem raízes adventícias facilmente, como
por exemplo as brotações das espécies herbáceas, a mesma facilidade não ocorre
quando se trabalha com espécies lenhosas (Grattapaglia & Machado, 1998).
De acordo com Rogalski et al. (2003) e Assis & Teixeira (1998), a
rizogênese, ou seja, o processo no qual ocorre a formação de raízes adventícias,
é uma das etapas mais difíceis e que pode limitar a micropropagação das
espécies do gênero Prunus spp.
De acordo com Silva (2004), as diferentes respostas dos genótipos aos
meios de enraizamento podem ser atribuídas às diferentes exigências nos níveis
hormonais.
56
Para a indução de raízes in vitro, geralmente, os meios de cultura são
acrescidos de diferentes tipos e concentrações de auxinas, sendo estas as
variáveis que mais influenciam no sucesso do enraizamento. No entanto, os
resultados da rizogênese podem variar entre as espécies de um mesmo gênero
(Al-Bahrany, 2002).
De modo geral, para a fase de enraizamento in vitro são utilizadas diluições
de formulações básicas do meio de cultura. Entretanto, os meios de enraizamento
que apresentam diluições excessivas podem ocasionar deficiência mineral,
principalmente na parte aérea das brotações enraizadas (Grattapaglia & Machado,
1998). Além disso, meios de cultura muito ricos em sais minerais podem inibir o
enraizamento, mesmo que estes contenham uma fonte de auxina (Silva, 2004).
Também deve-se levar em consideração a qualidade da parte aérea da brotação a
ser enraizada, pois brotações muito pequenas apresentam problemas de
enraizamento.
As fontes de auxinas mais utilizadas nos meios de enraizamento são o
ácido indolbutírico (AIB), o ácido naftaleno acético (ANA) e o ácido 3-indolacético
(AIA), os quais podem ser utilizados sozinhos ou em combinação. A concentração
utilizada nos meios de enraizamento podem variar de acordo com a espécie e/ou
cultivar, entretanto, as concentrações mais usadas no enraizamento in vitro de
Prunus spp. oscilam entre 0,1 e 1,0 mg L-1 (Rogalski et. al., 2003; Bertazza et al.,
1995; Rossi et al., 1993).
De acordo com Rogalski et al. (2003), a percentagem de enraizamento e o
número de raízes formadas podem variar de acordo com a concentração de AIB e
a cultivar utilizada; estes autores ainda ressaltam que a utilização de elevados
níveis de AIB tendem a afetar negativamente o enraizamento e o crescimento das
raízes, além de contribuir para a formação de calo na base dos explantes.
Segundo Fachinello et al. (1995), a formação de calo na região onde ocorre o
enraizamento é indesejável, pois a qualidade das raízes pode ser afetada,
principalmente ao que se refere à conecção vascular da planta.
57
Em relação à adição de sacarose no meio de enraizamento, a concentração
deve ser entre 2 e 3%, pois de acordo com George (1996), para ocorrer a
formação de raízes in vitro há necessidade de energia e carboidratos, quer sejam
estas fornecidas por meio da fotossíntese ou através de uma fonte exógena
adicionada ao meio de cultura. O fornecimento de uma fonte de carbono no meio
de cultura exerce influência na fisiologia da planta, diferenciação dos tecidos e,
também, na indução e diferenciação de órgãos.
Segundo Leite et al. (2002), na fase de enraizamento in vitro podem ser
utilizados, como substitutos do ágar, substratos inertes, como a vermiculita
embebida em meio de cultura líquido, a qual pode ser uma alternativa mais barata
do que o ágar. De acordo com Caldas et al. (1990), o meio de cultura acrescido
com vermiculita favorece a formação das raízes, devido à elevada aeração
promovida por este tipo de substrato.
Embora o ágar seja citado em vários trabalhos de enraizamento de
brotações in vitro, tem-se observado que o sistema radicular formado nas
brotações cultivadas no meio semi-solidificado com ágar é quebradiço e não
possui pêlos radiculares. Além disso, dentre os componentes do meio de cultura, o
ágar é a substância de maior custo (Leite, 1995). Segundo Pasqual et al. (2000), a
ausência de pêlos absorventes nas raízes formadas no meio com ágar pode
acarretar a morte logo após o transplante.
A baixa funcionalidade do sistema radicular formado no meio de
enraizamento in vitro pode resultar num baixo percentual de sobrevivência das
brotações na fase de aclimatização (Lane et al., 1992). O insucesso na
aclimatização talvez esteja associado ao fato das raízes sem pêlos serem pouco
eficientes na absorção de água e nutrientes.
A condição de cultivo na fase de enraizamento, geralmente, é realizada em
ambiente com fotoperíodo de 16 horas fornecida por uma fonte de luz branca,
obtidas por lâmpadas fluorescentes. No entanto, este tipo de luz não é mais
considerada
como
ótima,
por
possuir
vários
comprimentos
desnecessários e de baixa qualidade (Kim et al., 2004).
de
ondas
Vários autores
comprovaram o efeito da qualidade da luz em várias culturas in vitro e, entre os
58
resultados desses experimentos, destacam-se o alongamento de caules e folhas e
o aumento do comprimento da raiz (Zhou & Sing, 2002; Silva & Debergh, 1997).
Trabalhando com Prunus serotina, Fuernkranz et al. (1990) observaram que
a luz favoreceu a percentagem de enraizamento e o número de raízes formadas
por brotação. De acordo com Rossi et al. (1993), o mecanismo fisiológico pelo
qual a luz favorece o enraizamento ocorre devido à fixação de carbono, o qual
depende da eficiência da luz; os carbonos capturados pela eficiência da qualidade
da luz contribuem como uma fonte suplementar de carboidratos.
A qualidade da luz, ou seja, o comprimento de onda poderá ser alterado
pela utilização de diferentes filtros colocados sob a fonte de luz. A modificação
ocorre através da interceptação, absorção ou reflexo de determinados
comprimentos de onda (Li et al., 2000; Cerny et al., 2003). O ajuste do
comprimento de onda mais adequado, através do uso de filtros, poderá ser uma
alternativa importante na redução da concentração dos reguladores de
crescimento no meio de cultura.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de
sacarose e AIB, da utilização da vermiculita como substituto do ágar e de
diferentes filtros de luz no enraizamento in vitro de brotações do porta-enxerto de
Prunus cv. Mr. S. 2/5.
59
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1 Efeito do ágar, vermiculita e sacarose no enraizamento in vitro do
porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5
Objetivou-se neste trabalho avaliar o efeito de diferentes concentrações de
sacarose e a utilização de vermiculita como substituto do ágar no meio de
enraizamento in vitro das brotações.
Brotações estabelecidas in vitro, com quatro semanas de cultivo e medindo
aproximadamente 20 mm de comprimento, foram utilizadas para enraizamento in
vitro. O meio de cultura utilizado para indução do enraizamento constituiu de sais
e vitaminas do meio MS, acrescido de 0,0; 15; 30 e 60 g L-1 de sacarose, 100 mg
L-1 de mio-inositol e 1,2 mg L-1 de AIB. O pH do meio de cultura foi ajustado para
5,2 antes da adição de 7 g L-1 de ágar ou de 200 g L-1 de vermiculita. Após o
ajuste do pH, o meio de cultura acrescido de ágar foi dissolvido em água e, em
seguida, foi distribuído 30 mL de meio em frascos com capacidade de 250 mL.
Para os tratamentos com vermicula, primeiro realizou-se a distribuição do meio de
cultura líquido em frascos e, posteriormente, adicionou-se a vermiculita. Os
frascos foram autoclavados durante o intervalo de 15 minutos à temperatura de
120 ºC.
60
Em câmara de fluxo laminar, com o auxílio de pinça e bisturi, removeu-se o
primeiro par de folhas basais das brotações e, em seguida, as mesmas foram
inoculadas em frascos contendo o meio de cultura. Após a inoculação, os frascos
foram transferidos para sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas,
luminosidade de 25 µmol m-2 s-1 e temperatura de 25 + 1 ºC.
Após 30 dias, os explantes foram avaliados através dos seguintes
parâmetros: percentagem de enraizamento, número e comprimento médio de
raízes.
O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, em
esquema fatorial 2x4 (constituição do meio e concentrações de sacarose), com
quatro repetições. Cada repetição constituiu de um frasco com cinco brotações
cada.
4.2.2 Qualidade da luz e diferentes concentrações de AIB no enraizamento in
vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5
Este trabalho foi realizado com o objetivou de verificar o efeito da qualidade
da luz e AIB no enraizamento in vitro do cv. Mr. S. 2/5.
Foram utilizadas brotações provenientes da multiplicação in vitro e medindo
aproximadamente 20 mm. Em câmara de fluxo laminar, eliminou-se o primeiro par
de folhas basais das brotações e em seguida as mesmas foram inoculadas em
frascos contendo 40 mL de meio de cultura. O meio de cultura utilizado foi o meio
MS ¾ acrescido por 0,0; 0,3; 0,6 e 0,9 mg L-1 de IBA, 30 g L-1 de sacarose, 100
mg L-1 de mio-inositol, 7 g L-1 de ágar e pH 5,2. O meio de cultura foi autoclavado
a 121 ºC durante 15 minutos. Após a inoculação, os frascos com os explantes
foram transferidos para sala de crescimento com 16 horas de fotoperíodo,
luminosidade de 25 µmol m-2 s-1 e temperatura de 25 + 1 ºC. Sobre os frascos
foram colocadas folhas de filtros da marca Lee Filters (Walworth Ind. Estate,
Andover, England): o filtro verde (nº 088 Lime green) transmite 69% da luz verde
com comprimento de onda de 520 nm, 35% da luz vermelha com comprimento de
61
onda de 670 nm e 2% da luz azul com comprimento de onda de 460 nm; o filtro
azul (nº 118 Light blue) transmite 22% da luz azul, 40% da luz verde e 0% de luz
vermelha; e o filtro verde (nº 738 Jas green) transmite 18% da luz verde, 1% da
luz vermelha e 0% da luz azul. No tratamento controle, os frascos permaneceram
sem cobertura.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado em
esquema fatorial 4x4 (concentrações de AIB e tipos de filtros), com quatro
repetições por tratamento. Cada repetição constituiu de um frasco com cinco
explante cada.
Após 35 dias de cultivo foram analisadas as variáveis: percentagem de
enraizamento, número médio de raízes e comprimento médio das raízes (mm).
Para
análise
estatística,
os
dados
obtidos
nos
experimentos de
enraizamento foram submetidos à análise de variância e as médias dos
tratamentos comparadas pelo teste de Duncan ou analisados por regressão
polinomial, através do programa estatístico Sanest (Zonta & Machado, 1992). Os
dados expressos em percentagem de enraizamento foram transformados segundo
arco seno da raiz quadrada de x/100 e o número de raízes foram transformados
segundo raiz quadrada de (x+0,5), sendo x= número médio de raízes.
62
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3.1 Efeito do ágar, vermiculita e sacarose no enraizamento in vitro do
porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5
De acordo com os dados da análise da variância para a variável
percentagem de enraizamento, houve diferença nos dois fatores (constituição do
meio e concentração de sacarose), porém não houve interação entre eles. Podese observar, por meio da Tabela 1, que a maior percentagem de enraizamento das
brotações ocorreu no meio de cultura MS acrescido com vermiculita. De acordo
com Maciel et al. (2002) e Caldas (1990), os suportes físicos porosos, utilizados
na fase de enraizamento contribuem, positivamente para o enraizamento devido à
elevada aeração, como é o caso da vermiculita.
63
TABELA 1- Percentagem de enraizamento e número de raízes formadas pelas
brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em meio MS acrescido de
ágar ou vermiculita. UFPel, Pelotas-RS, 2006
Constituição do meio
Percentagem de
Número de raízes
enraizamento
MS + Vermiculita
55,1 a
1,5 b
MS + Ágar
35,9 b
2,0 a
* Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan
em nível de 5% de probabilidade.
Com relação à influência da sacarose sobre a percentagem de
enraizamento das brotações da cv.
Mr. S. 2/5, observou-se que no meio de
cultura desprovido de sacarose não ocorreu formação de raízes (Figura 1). A
presença de carboidrato é essencial para que ocorra a formação das raízes em
muitas espécies cultivadas in vitro (Grattapaglia & Machado, 1998). Uma vez que
a formação de raízes é um processo que demanda energia (George, 1996). E para
muitas espécies cultivadas in vitro, a fotossíntese realizada nessas condições é
baixa e se faz necessário o fornecimento de uma fonte externa de carboidrato
(Leite et al., 2002). Entretanto, pode-se observar que a utilização de
concentrações de sacarose superiores a 34,45 g L-1 influenciaram negativamente
o enraizamento do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5.
Brotações enraizadas (%)
64
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
y = -0,073x +5,03x+5,19
2
R = 0,92
15
30
60
Concentração de sacarose (g L-1)
FIGURA 1- Percentagem de enraizamento do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5 cultivado
no meio MS, com diferentes concentrações de sacarose. UFPel,
Pelotas-RS, 2006
Para a variável número médio de raízes, não ocorreu interação entre os
fatores, porém houve diferença significativa em função da constituição do meio de
cultura e a concentração de sacarose. Observa-se ainda, através da tabela 1, que
o maior número médio de raízes formadas ocorreu com as brotações cultivadas no
meio de cultura acrescido de ágar. Hoffmann et al. (2001), trabalhando com dois
porta-enxertos de macieira, observaram que o meio solidificado com ágar
proporcionou a maior formação de raízes no porta-enxerto Marubakaido, porém
para a cv. M-26 não houve diferença entre o meio solidificado com ágar e o meio
acrescido de ágar e vermiculita.
O número de raízes formadas foi nulo para as brotações do cv. Mr. S. 2/5
cultivadas no meio de cultura sem sacarose (Figura 2). Esses resultados reforçam
a afirmação feita por Leite et al. (2002), de que a presença de carboidratos no
meio de cultura in vitro é essencial para a indução de raízes. Observou-se que as
concentrações estimadas de sacarose no meio de cultura, acima de 38,89 g L-1
proporcionaram a indução de 2,91 raízes por brotação. Esses resultados diferem
65
dos obtidos por Pio et al. (2002), que observam um efeito linear crescente no
número de raízes formadas quando as brotações de porta-enxerto de citrus
(Tangerina sunki x Trifoliata english 63-256) foram cultivadas no meio de cultura
acrescido por 0,0; 30 e 60 mg L-1 de sacarose e 2,0 mg L-1 de AIB. Entretanto,
com concentrações entre 15 e 60 g L-1 houve incremento em relação à
testemunha, porém sem diferença entre os demais tratamentos.
Número de raízes
3,5
3
2,5
2
1,5
2
y = -0,0018x +0,14x+0,19
1
2
R = 0,89
0,5
0
0
15
30
45
60
Concentração de Sacarose (g L-1)
FIGURA 2- Número médio de raízes formadas das brotações do porta-enxerto cv.
Mr.S. 2/5 provenientes do cultivo em meio MS com diferentes
concentrações de sacarose. UFPel, Pelotas-RS, 2006
Para a variável comprimento médio de raízes formadas, ocorreu interação
significativa entre os fatores constituição do meio e concentração de sacarose. As
raízes de maior comprimento surgiram quando as brotações do porta-enxerto cv.
Mr.S. 2/5 foram cultivadas nos meios de cultura acrescidos de ágar (Figura 3 e 4).
Por meio da figura 3, verifica-se uma resposta linear crescente para a
variável comprimento médio de raízes, com o acréscimo das diferentes
concentrações de sacarose no meio de cultura solidificado com ágar. Contudo,
essa resposta não se repetiu com as brotações cultivadas no meio com
66
vermiculita, observando-se uma tendência de redução no comprimento médio de
raízes a partir da utilização de 35,05 g L-1 de sacarose. De acordo com
Grattapaglia & Machado (1998), as raízes mais curtas são as mais adequadas
para o transplantio, devido às mesmas se encontrarem em fase de crescimento
ativo, facilitarem a retirada do meio de cultura aderido e evitarem a quebra. O
comprimento da raiz mais adequado é de 20 a 30 mm, pois, dependendo do
diâmetro do frasco e número de explantes cultivados, as raízes começam a
enovelar entre si.
Os resultados obtidos neste experimento mostram que a sacarose exerceu
importante influência na formação das raízes in vitro. Entretanto, não foi
evidenciada importância da utilização de sacarose em concentrações muito acima
de 30 g L-1 no meio de enraizamento, exceto para o comprimento de raízes no
meio de cultura acrescido com ágar. Houve também, resultado satisfatório na
utilização da vermiculita no meio de cultura, podendo esta ser utilizada com
Comprimento de raízes (mm)
eficiência na substituição do ágar em meios de enraizamento.
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
y = 0,55x + 7,5
R2= 0,80
2
y = -0,0107x + 7,5x +93
2
R =0,89
0
15
30
Ágar
▪Vermiculita
60
Concentração de Sacarose (g L-1)
FIGURA 3- Comprimento médio de raízes formadas pelo porta-enxerto cv. Mr.S.
2/5 cultivado no meio MS, acrescido de vermiculita ou ágar, em
diferentes concentrações de sacarose. UFPel, Pelotas-RS, 2006.
67
FIGURA 4- Brotações de Mr.S. 2/5 provenientes do cultivo em meio de cultura MS
com ágar ou vermiculita (esquerda/direita). UFPel, Pelotas-RS, 2006.
4.3.2 Qualidade da luz e diferentes concentrações de AIB no enraizamento in
vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5
Na figura 5 pode-se notar um comportamento linear crescente da
percentagem de enraizamento com o aumento da concentração de AIB no meio
de cultura. As maiores percentagens de enraizamento (95,7% e 85,6%) foram
observadas nas brotações cultivadas no meio de cultura acrescido por 0,9 e 0,6
mg L-1 de AIB. Os resultados obtidos neste trabalho evidenciam a necessidade de
AIB para o enraizamento das brotações do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5,
pois as brotações cultivadas no meio de cultura sem AIB (tratamento controle) não
formaram raízes. Rogalski et al. (2003), trabalhando com o porta-enxerto de
Prunus cv. GF 677, obtiveram 40% e 60% de enraizamento com as brotações
cultivadas no meio de cultura acrescido por 1,0 e 0,5 mg L-1 de AIB,
respectivamente.
Erig & Schuch (2004) verificaram que as brotações de
marmeleiro cv. ‘MC’ cultivadas no meio de cultura sem AIB não formaram raízes.
Campos (2005), trabalhando com o porta-enxerto cv. Mr. S. 1/8 no meio de cultura
sem AIB, obteve 5,3% de enraizamento. Segundo o mesmo autor, o enraizamento
observado no meio de cultura sem AIB ocorreu possivelmente devido à presença
de auxina endógena. Porém, a concentração de auxina endógena no explante
pode variar de acordo com a espécie ou, até mesmo, com a cultivar.
Percentagem de brotações
enraizadas da cv. Mr. S. 2/5
68
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
y = 89,80x + 4,1
2
R = 0,95
0
0,3
0,6
0,9
-1
Concentração de AIB (mg L )
FIGURA 5- Percentagem de enraizamento in vitro das brotações da cv. Mr. S. 2/5,
cultivadas em meio MS acrescido de diferentes concentrações de AIB.
UFPel, Pelotas-RS, 2006.
A
qualidade
da
luz
não
influenciou
a
variável
percentagem
de
enraizamento. Este resultado difere dos obtidos por Bertazza et al. (1995) que,
trabalhando com a pereira cv. Conference, verificaram que as brotações cultivadas
sob filtro vermelho tiveram a maior percentagem de enraizamento (90%) e maior
número de raízes. Antonopoulou et al. (2004), trabalhando com o porta-enxerto de
Prunus cv. GF 677, observaram que o percentual de enraizamento das brotações
cultivadas sob luz branca foi superior as demais (vermelho, azul, verde e amarelo).
Fuernkranz et al. (1990), trabalhando com Prunus serotina, obtiveram a maior
percentagem de enraizamento (97%) e número médio de raízes (5,7) utilizando o
filtro amarelo. Embora, a luz seja considerada um importante fator na formação de
raízes adventícias das plantas micropropagadas (Tyburski & Tretyn, 2004), esta
habilidade da planta em formar raízes depende da
interação de muitos fatores
69
endógenos e exógenos (Molassiotis et al., 2003) e, portanto, os resultados
considerados ótimos em uma determinada espécie, não podem ser extrapolados
para outra, pois o efeito da luz na formação das raízes adventícias varia com a
espécie e cultivar (Bertazza et al., 1995).
Para a variável número médio de raízes houve interação entre os fatores
estudados. Pode-se observar na figura 6, um comportamento linear crescente do
número médio de raízes com o aumento da concentração de AIB, nas brotações
cultivadas sob o filtro azul nº 118, verde nº 738 e tratamento controle. Já para as
brotações cultivadas sob o filtro verde nº 088, observou-se um comportamento
quadrático (Figura 6). Tibola et al. (2004) verificaram que as brotações dos portaenxertos de Prunus cvs. Marianna e Mr. S. 2/5 cultivadas no meio de cultura
acrescido por 1,5 mg L-1 de AIB formaram 4,0 e 2,7 raízes. Rogalski et al. (2003)
verificaram a formação de 3,5 e 4,8 raízes nas brotações do porta-enxerto de
Prunus cv. GF 677 cultivadas no meio de cultura suplementado por 0,5 e 1,0 mg
L-1 de AIB.
Nota-se que o aumento da concentração de AIB no meio de cultura do
presente trabalho e também no de Rogalski et al. (2003) contribuiu para a
formação do maior número de raízes. No entanto, deve-se verificar para cada
genótipo a concentração de AIB mais adequada para evitar a formação de calo na
base do explante, o qual interfere negativamente na fase de aclimatação e na
inibição do enraizamento, devido à toxidade causada pelas altas concentrações.
Neste sentido, Ahmad et al. (2003) verificaram a formação de calo e a
inibição do desenvolvimento das raízes em brotações do porta-enxerto cv. GF 677
cultivado em meio de cultura acrescido por 4,0 mg L-1 de AIB. Caboni et al. (1997),
trabalhando com sete genótipos de Prunus (M49, M50, M51, M52, M53, M54 e
M55), verificaram que o número de raízes formadas por brotação no meio de
cultura acrescido por 1 mg L-1 de AIB variou entre 1,1 e 3,6 raízes,
respectivamente.
70
Número médio de
raízes (mm)
2,5
2
1,5
1
-- Verde 088
--- ▪ Azul 118
0,5
y = -2,20x2 + 2,98x + 0,73
y = 1,25x + 0,85
― Verde 738 y = 1,49x + 0,75
__
Controle
R2 = 0,96
2
R = 0,90
2
R = 0,97
y = 1,05x + 0,86
R2 = 0,83
0
0
0,3
0,6
0,9
-1
Concentrações de AIB (mg L )
FIGURA 6- Número médio de raízes formadas por brotações da cv. Mr. S. 2/5, em
meio MS acrescido de diferentes concentrações de AIB e cultivadas
sob diferentes filtros de luz. UFPel, Pelotas-RS, 2006.
Para
a
variável
comprimento
médio
das
raízes,
obteve-se
um
comportamento quadrático com o aumento da concentração de AIB no meio de
cultura. O maior comprimento médio das raízes (25 mm) foi observado nas
brotações cultivadas no meio de cultura contendo 0,3 mg L-1 de AIB (Figura 7). De
acordo com Radmann et al. (2002), as auxinas, quando utilizadas em baixas
concentrações no meio de cultura, estimulam o alongamento das raízes,
entretanto as altas concentrações de AIB inibem o crescimento das raízes devido
ao fato de esta substância também estimular a produção de etileno. Tibola et al.
(2004) verificaram o maior comprimento médio das raízes (24 mm) com as
brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 cultivadas no meio de cultura acrescido
por 1,5 mg L-1 de AIB.
Em relação ao efeito da qualidade da luz, observou-se que o comprimento
médio das raízes das brotações não foi influenciado por este tratamento (Figura
8). Estes resultados diferem dos obtidos por Bertazza et al. (1995) que,
71
trabalhando com a pereira cv. Doyenne, observaram que as brotações cultivadas
sob filtro azul e controle formaram raízes com 24 mm e 21 mm, respectivamente.
Rossi et al. (1993), trabalhando com o porta-enxerto do cv. GF 655-2, observaram
o maior comprimento das raízes nas brotações cultivadas sob filtro vermelho (filtro
Lee 106). De acordo com Bielenin (2000), as condições ambientais (temperatura e
luz), os reguladores de crescimento e o meio de cultura entre outros, são fatores
importantes para o sucesso do enraizamento e que estas condições de cultivo
devem ser ajustadas de acordo com a espécie, ou mesmo, com a cultivar.
Comprimento médio
das raízes (mm)
30
25
20
15
y = -6,76x2 + 7,98x + 0,16
2
R = 0,86
10
5
0
0
0,3
0,6
0,9
-1
Concentração de AIB (mg L )
FIGURA 7- Comprimento médio das raízes das brotações da cv. Mr. S. 2/5,
cultivadas em meio MS acrescido de diferentes concentrações de
AIB. UFPel, Pelotas-RS, 2006.
72
FIGURA 8- Aspecto das brotações enraizadas do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5,
provenientes do cultivo em meio MS acrescido por diferentes
concentrações de AIB e cultivadas sob luz branca. UFPel, PelotasRS, 2006.
73
4.4 CONCLUSÕES
1- A presença de sacarose no meio de cultura é imprescindível para o
enraizamento in vitro de brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5;
2- Para o enraizamento das brotações do porta-enxerto cv Mr. S. 2/5 a vermiculita
pode substituir o ágar no meio de cultura;
3- Concentração de sacarose acima de 30 g L-1 no meio de cultura MS adicionada
a 200 g L-1 de vermiculita, não aumenta o comprimento das raízes;
4- Os filtros de luz testados não contribuíram para o aumento do percentual de
enraizamento in vitro das brotações.
74
5- CONSIDERAÇÕES FINAIS
i- O estabelecimento in vitro dos porta-enxetos de Prunus, a partir de plantas
mantidas em casa de vegetação e controle fitossanitário permitem o controle
da contaminação;
ii- Os porta-enxerto podem ser estabelecidos a partir de segmentos nodais em
meio de cultura desprovido de reguladores de crescimento (BAP);
iii- A brotação se estabelece bem, mas, ao separá-la do segmento da planta
matriz observa-se uma perda do vigor muito acentuada;
iv- Os ápices caulinares formam brotações, no entanto com o explante basal a
grande maioria morre;
v- Manter plantas em telados, renová-las devido perda do vigor;
vi- No experimento com filtro de luz, utilizar meio e concentração de regulador de
crescimento único, e testar um maior número de filtros. Há indicativo de que
para cada fase de cultivo existe uma faixa de onde a ser explorada, dentro de
cada cor.
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87
APÊNDICE
TABELA 1A – Resumo da análise de variância para as variáveis da percentagem
de contaminação (fúngica e bacteriana) e percentagem de
estabelecimento dos explantes dos porta-enxertos cv. Flordaguard,
Nemaguard, Nemared e Mr. S. 2/5. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS,
2006
Causa da
variação
GL
Cultivar (A)
Explante (B)
A*B
Resíduo
Media Geral
CV
3
1
3
181
Quadrados médios
(%) Contaminação
(%) Contaminafúngica
ção bacteriana
55,1196ns
0,0009ns
111,9882ns
84,3988
1,1756
781,42
167,3061ns
0,0073ns
0,0011ns
84,3918
1,1801
778,45
(%)
Estabelecimento
29913,3733**
15148,0055**
8768,8285**
1276,7964
53,0721
67,33
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 2A – Resumo da análise de variância para as variáveis da percentagem
de contaminação (fúngica e bacteriana), percentagem de
estabelecimento e oxidação dos explantes do porta-enxerto cv. Mr.
S. 2/5. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da
variação
GL
Solidificante (A)
Explante (B)
A*B
Resíduo
Media Geral
CV
2
1
2
135
(%)
Contaminação
fúngica
0,0018ns
56,6152ns
223,2862ns
167,0055
2,1096
612,57
Quadrados médios
(%)
(%)
ContaminaEstabelecição
mento
bacteriana
0,0002ns
0,0019ns
0,0032ns
0,0046
0,2321
29,34
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
7211,6573*
50372,5930**
8228,0860*
1457,2506
52,5987
72,57
(%)
Oxidação
7214,9910*
53755,9713**
10795,3875**
1365,8956
35,7687
103,33
88
TABELA 3A – Resumo da análise de variância para as variáveis do comprimento
médio das brotações, número médio de folhas e percentagem de
vitifricação dos explantes dos porta-enxertos cv. Mr. S. 2/5.
Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da
variação
GL
Comprimento da
Quadrados médios
Número de folhas
brotação
Solidificante (A)
Explante (B)
A*B
Resíduo
Media Geral
CV
2
1
2
135
17,7014**
96,4854**
18,8278**
0,6540
2,1689
37,28
6,4795**
40,5609**
11,0429**
0,3750
1,8497
33,11
(%)
Vitrificação
10729,7168**
27063,5936**
10977,7850**
588,4091
15,2062
159,52
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 4A – Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem de
contaminação
(fúngica
e
bacteriana), percentagem de
estabelecimento e oxidação dos explantes do porta-enxerto cv. Mr.
S. 2/5. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da
variação
GL
Tipo de filtro
Resíduo
Media Geral
CV
4
15
(%)
Contaminação
fúngica
147,7588ns
137,4973
6,7514
173,68
Quadrados médios
(%)
(%)
ContaminaEstabelecição
mento
bacteriana
0,0007ns
0,0035
0,2538
23,61
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
125,1661ns
302,5881
75,34
23,08
(%)
Oxidação
21,8756ns
254,4336
9,6718
164,92
89
TABELA 5A – Resumo da análise de variância para as variáveis número médio
de folhas, comprimento médio das brotações e número de gemas
do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS,
2006
Causa da
variação
GL
Tipo de filtro
Resíduo
Media Geral
CV
4
15
Quadrados médios
Número de folhas
Comprimento
da brotação
Número de
gemas
0,4454**
0,0463
2,6938
7,98
62,8985*
7,3052
7,5310
35,89
0,1863*
0,0264
1,74
9,32
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 6A – Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem de
contaminação
(fúngica
e
bacteriana), percentagem de
estabelecimento e comprimento médio das brotações do portaenxerto cv. Tsukuba. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da
variação
GL
Meio (A)
BAP (B)
A*B
Resíduo
Media Geral
CV
2
3
6
36
(%)
Contaminação
fúngica
113,0104ns
365,4477 ns
123,5463ns
126,9437
7,6636
147,02
Quadrados médios
(%)
(%)
ContaminaEstabelecição
mento
bacteriana
47,1859ns
47,4947 ns
47,2387 ns
15,8314
1,2352
322,13
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
163,2057ns
455,4446 ns
163,3667ns
130,9529
81,6716
14,01
(mm)
Comprimento
da brotação
2,2409ns
5,3930*
2,7302ns
1,6099
4,1114
30,86
90
TABELA 7A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento médio
das brotações do porta-enxerto cv. Tsukuba em função da
concentração de BAP. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causas da variação
G.L
Quadrado médio
Número de brotação
Regressão linear
Regressão quadrática
Desvio de regressão
Resíduo
1
1
1
36
0,0152ns
14,8630*
1,3009
1,6099
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 8A – Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem de
contaminação
(fúngica
e
bacteriana), percentagem de
estabelecimento e comprimento médio das brotações do portaenxerto cv. Sírio. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da
variação
Posição/gema (A)
Meio (B)
A*B
Resíduo
Media Geral
CV
GL
(%)
Contaminação
fúngica
1
2
2
18
28,3963ns
115,2718ns
115,7887ns
201,3857
12,3368
115,03
Quadrados médios
(%)
(%)
ContaminaEstabelecição
mento
bacteriana
28,0012ns
28,7040ns
29,6284ns
28,7860
1,3670
392,48
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
5277,1064**
23,7300ns
24,9781ns
147,6141
61,8501
19,64
Comprimento
da brotação
0,1302ns
2,8517ns
0,4428ns
0,6872
6,3513
13,05
91
TABELA 9A – Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem de
brotação, número médio de brotações, comprimento médio das
brotação e número médio de folhas dos porta-enxertos cvs. Sírio e
Mr. S. 2/5. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da
variação
Cultivar (A)
BAP (B)
Meio (C)
A*B
A*C
B*C
A*B*C
Resíduo
Media Geral
CV
GL
1
3
1
3
1
3
3
48
Quadrados médios
(%) Brotação
Número de
4794,9828**
175,8162ns
1,2895ns
52,2624ns
1848,0458ns
561,5315ns
119,5124ns
291,7223
64,5720
26,45
brotação
Comprimento
da brotação
0,2737**
0,0546**
0,0021ns
0,0243*
0,0094ns
0,0138ns
0,0085ns
0,0078
1,3111
6,76
0,9247*
0,0758ns
2,7759**
0,1334ns
0,6422*
0,0168ns
0,1322ns
0,0784
0,7622
36,75
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 10A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de
brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da
concentração de BAP. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causas da variação
G.L
Quadrado médio
Número de brotação
Regressão linear
Regressão quadrática
Desvio de regressão
Resíduo
1
1
1
48
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
0,1508**
0,0253ns
0,0375
0,0078
92
TABELA 11A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de
brotações do porta-enxerto cv. Sírio em função da concentração de
BAP. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causas da variação
G.L
Quadrado médio
Número de brotação
Regressão linear
Regressão quadrática
Desvio de regressão
Resíduo
1
1
1
48
0,0169*
0,0052ns
0,0010
0,0078
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 12A – Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem
de brotação, número médio de brotações, comprimento médio
das brotações do porta-enxerto cv. Tsukuba. Capítulo 2. UFPel,
Pelotas- RS, 2006
Causa da
variação
GL
Explante (A)
BAP (B)
A*B
Resíduo
Media Geral
CV
1
3
3
24
(%) Brotação
Quadrados médios
Número de
brotação
45800,4635**
262,9517ns
550,1167ns
128,8211
47,8887
23,70
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
1,0050**
0,0757ns
0,0744ns
0,0193
1,0467
13,28
Comprimento
da brotação
494,8343**
6,2514*
4,5732*
0,8516
4,8714
18,94
93
TABELA 13A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento
médio das brotações, a partir do explante ápice do portaenxerto cv. Tsukuba em função da concentração de BAP.
Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da variação
Regressão linear
Regressão quadrática
Desvio de regressão
Resíduo
GL
1
1
1
24
Quadrado médio
3,9694**
8,9102*
2,4290
0,8516
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 14A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento
médio das brotações, a partir do explante segmento nodal do
porta-enxerto cv. Tsukuba em função da concentração de BAP.
Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da variação
Regressão linear
Regressão quadrática
Desvio de regressão
Resíduo
GL
1
1
1
24
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
Quadrado médio
7,8012**
1,5600ns
7,8037
0,8516
94
TABELA 15A – Resumo da análise de variância para as variáveis número médio
de brotações, número médio de folhas e comprimento médio das
brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Capítulo 2. UFPel,
Pelotas- RS, 2006
Causa da
variação
GL
BAP (A)
Filtro/luz (B)
A*B
Resíduo
Media Geral
CV
3
3
9
48
Quadrados médios
Número de
brotação
Número de
folhas
Comprimento
da brotação
1,1710**
0,0468ns
0,1375ns
0,0209
1,3985
10,34
0,8588*
2,3309**
0,7603*
0,1447
1,8528
20,53
10,4143*
15,2256*
10,9099*
3,2694
4,8225
37,49
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 16A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de
brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da
concentração de BAP. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da variação
Regressão Linear
Regressão Quadratica
Desvio de regressão
Resíduo
GL
1
1
1
48
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
Quadrado médio
2,5873**
0,8662**
0,0591
0,0291
95
TABELA 17A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento
médio das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função
da concentração de BAP e sob o cultivo dos filtros Verde Nº 088
e Azul Nº 118. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da variação
GL
Regressão Linear
Regressão Quadratica
Desvio de regressão
Resíduo
1
1
1
48
Quadrados médios
Verde Nº 088
Azul Nº 118
10,2980ns
0,1623ns
5,8743
3,2694
25,8374*
30,3574**
18,3572
3,2694
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 18A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento
médio das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função
da concentração de BAP e cultivo sob o filtro Verde Nº 738 e o
Controle. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da variação
GL
Regressão Linear
Regressão Quadratica
Desvio de regressão
Resíduo
1
1
1
48
Quadrados médios
Verde Nº 738
Controle
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
8,6702ns
0,3900ns
0,5100
3,2694
17,7270*
11,2446ns
0,0086
3,2694
96
TABELA 19A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de
folhas do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da concentração
de BAP e cultivo sob os filtros Verde Nº 088 e Azul Nº 118.
Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da variação
GL
Regressão Linear
Regressão Quadratica
Desvio de regressão
Resíduo
1
1
1
48
Quadrados médios
Verde Nº 088
Azul Nº 118
2,6221**
0,0548ns
0,3751
0,1447
0,7062*
1,2803**
0,9402
0,1447
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 20A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de
folhas do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da concentração
de BAP e cultivo sob o filtro Verde Nº 738 e o Controle. Capítulo
2. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da variação
GL
Regressão Linear
Regressão Quadratica
Desvio de regressão
Resíduo
1
1
1
48
Quadrados médios
Verde Nº 738
Controle
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
0,6915*
0,0245ns
0,1938
0,1447
1,0316*
1,2067**
0,2921
0,1447
97
TABELA 21A - Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem de
enraizamento, número médio de raízes e comprimento médio das
raízes do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Capítulo 3. UFPel, PelotasRS, 2006
Causa da
variação
GL
Solidificante (A)
Sacarose (B)
A*B
Resíduo
Media Geral
CV
1
3
3
24
(%) Enraizamento
Quadrados médios
Número de raiz
986,5485*
6993,8933**
312,9454ns
113,4728
42,3801
25,14
0,1278*
2,0338**
0,0194ns
0,0275
1,4646
11,34
Comprimento
da raiz
1603,2241**
833,3165**
301,4932**
19,8742
14,9786
29,76
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 22A - Análise de regressão polinomial para as variáveis percentagem de
enraizamento e número médio de raízes do porta-enxerto cv. Mr. S.
2/5 em função da concentração de sacarose. Capítulo 3. UFPel,
Pelotas- RS, 2006
Causa da variação
GL
Regressão linear
Regressão quadrática
Desvio de regressão
Resíduo
1
1
1
24
Quadrados médios
(%) Enraizamento Número de raiz
4049,2131**
15124,0710**
1808,3967
113,4728
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
2,8273**
2,6349**
0,693
0,0275
98
TABELA 23A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento
médio das raízes do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da
concentração de sacarose no meio com ágar ou vermiculita.
Capítulo 3. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da variação
GL
Regressão Linear
Regressão Quadratica
Desvio de regressão
Resíduo
1
1
1
24
Quadrados médios
Ágar
Vermiculita
2417,9483**
563,0630*
32,6035
19,8742
50,8516ns
299,9543**
40,0084
19,8742
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 24A - Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem de
enraizamento, número médio das raízes e comprimento médio das
raízes do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Capítulo 3. UFPel, PelotasRS, 2006
Causa da
variação
GL
AIB (A)
Filtro/luz (B)
A*B
Resíduo
Media Geral
CV
3
3
9
48
(%) Enraizamento
Quadrados médios
Número de raiz
20199,7842**
140,6704ns
91,1396ns
111,1504
44,5091
23,68
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
3,7938**
0,0291ns
0,0689*
0,0224
1,3881
10,79
Comprimento
da raiz
19,2720**
1,0927ns
0,4539ns
0,2773
1,6259
32,39
99
TABELA 25A - Análise de regressão polinomial para a variável percentagem de
enraizamento das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em
função das concentrações de AIB. Capítulo 3. UFPel, PelotasRS, 2006
Causa da variação
Regressão linear
Regressão quadrática
Desvio de regressão
Resíduo
GL
1
1
1
48
Quadrado médio
58071,4699**
1817,4949**
710,3812
111,1540
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 26A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de
raízes formadas pelas brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5,
em função das concentrações de AIB e cultivo sob os filtros
Verde Nº 088 e Azul Nº 118. Capítulo 3. UFPel, Pelotas- RS,
2006
Causa da variação
GL
Regressão Linear
Regressão Quadratica
Desvio de regressão
Resíduo
1
1
1
48
Quadrados médios
Verde Nº 088
Azul Nº 118
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
1,8089**
0,6274**
0,0440
0,0224
2,8146**
0,2646**
0,0349
0,0224
100
TABELA 27A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de
raízes formadas pelas brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5,
em função das concentrações de AIB e cultivo sob o filtro Verde
Nº 738 e o Controle. Capítulo 3. UFPel, Pelotas- RS, 2006
Causa da variação
GL
Regressão Linear
Regressão Quadratica
Desvio de regressão
Resíduo
1
1
1
48
Quadrados médios
Verde Nº 738
Controle
3,9966**
0,0318ns
0,0011
0,0224
1,9785**
0,1351*
0,0263
0,0224
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
TABELA 28A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento meio
das raízes das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em
função das concentrações de AIB. Capítulo 3. UFPel, PelotasRS, 2006
Causa da variação
Regressão linear
Regressão quadrática
Desvio de regressão
Resíduo
GL
1
1
1
48
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F
ns
Não significativo
Quadrado médio
26,0684**
23,6901**
8,0575
0,2774