CURSO AVALIAÇÃO DA CONFORMIDADE DE MATERIAL BIOLÓGICO
MÉTODOS RÁPIDOS DE
ANÁLISE DE MATERIAL
BIOLÓGICO: BAX E
RIBOPRINTER
LIDIANE BOTELHO
[email protected]

IMPORTÂNCIA DAS ANÁLISES
(QUAIS,
QUANTOS, CONDIÇÕES HIGIÊNICAS, RISCOS, VIDA
ÚTIL);

DETERMINAÇÃO
DO
ETIOLÓGICO (TOXINFECÇÕES)

PADRÕES
ADEQUADOS

ANÁLISES
E
AGENTE
ESPECIFICAÇÕES
PODEM
INVESTIGAR
-
PRESENÇA OU AUSÊNCIA, QUANTIFICAR, IDENTIFICAR
E CARACTERIZAR AS DIFERENTES ESPÉCIES.
MÉTODOS CLÁSSICOS
(CONVENCIONAIS) X MÉTODOS RÁPIDOS
MÉTODOS CLÁSSICOS (CONVENCIONAIS)
-Desenvolvidos a muito tempo;
-Empregados como métodos oficiais;
-Métodos
estão
descritos
em
publicações
consideradas de referência, internacionalmente
aceitas.
MÉTODOS RÁPIDOS
Abreviar o tempo necessário para a obtenção dos
resultados;
-Melhorar a produtividade laboratorial;
-Simplificação do trabalho;
-Redução de custos;
-Maior sensibilidade e especificidade que os métodos
convencionais.
PRINCIPAIS MÉTODOS CONVENCIONAIS
E SUAS DESVANTAGENS:
-CONTAGEM POR PLAQUEAMENTO:
É A MAIS UTILIZADA PORÉM É MUITO TRABALHOSA QUANDO
MUITAS DILUIÇÕES PRECISAM SER ANALISADAS OU QUANDO O
NÚMERO DE AMOSTRAS É GRANDE. LEITURA TAMBÉM PODE SER
DIFÍCIL, CANSATIVA E IMPRECISA.
- NÚMERO MAIS PROVÁVEL:
ESTIMAR A CONTAGEM DE ALGUNS MICRORGANISMOS
COLIFORMES). MÉTODO BASTANTE ANTIGO MAS OS RESULTADOS
SÃO IMPRECISOS, UMA VEZ QUE PERMITE APENAS UMA
ESTIMATIVA DO NÚMERO PRESENTE.
OUTRAS DESVANTAGENS NOS
MÉTODOS CONVENCIONAIS SÃO:
- SEMEADURAS EM MEIOS DE CULTURA PARA O
ISOLAMENTO
DE
COLÔNIAS
E
TESTES
COMPLEMENTARES PARA A IDENTIFICAÇÃO;
Pré-enriquecimento em caldo não seletivo (18 horas);
Enriquecimento em caldo seletivo (18 - 24 horas);
Plaqueamento seletivo diferencial (18h - 37ºC)
Confirmação
-ALGUNS
MICRORGANISMOS
SE
APRESENTAM
INJURIADOS (ETAPA DE PRÉ-ENRIQUECIMENTO);
-ENRIQUECIMENTO SELETIVO (ADICIONAL);
- MÉTODOS BASEADOS NO COMPORTAMENTO
BIOQUÍMICO FRENTE A DIFERENTES SUBSTRATOS
(REAÇÕES BIOQUÍMICAS);
Rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo)
com ou sem produção de H2S (escurecimento do ágar).
Fermentação da lactose
NOS ÚLTIMOS ANOS VÁRIAS
TÉCNICAS TÊM SIDO PROPOSTAS E
AVALIADAS;
-SIMPLIFICAM E MELHORAM A PRECISÃO DOS
RESULTADOS DE IDENTIFICAÇÃO;
NOVOS MÉTODOS - CLASSIFICADOS EM:
-TÉCNICAS BIOQUÍMICAS MINIATURIZADAS
-TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
-TÉCNICAS GENÉTICAS
BAX
BAX SYSTEM
DETECÇÃO DE PATÓGENOS;
-Salmonella sp
-Listeria sp
-Listeria monocytogenes
-E. coli O157:H7;
-Enterobacter sakazakii
-CARACTERÍSTICAS
-ANÁLISE DE PRESENÇA OU AUSÊNCIA;
-UTILIZA A TÉCNICA PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION);
-DETECÇÃO DO DNA BACTERIANO;
-TOTALMENTE AUTOMATIZADO
(AMPLIFICAÇÃO, DETECÇÃO E INTERPRETAÇÃO);
-ALTO
VOLUME
DE
ANÁLISE
(96
AMOSTRAS
SIMULTÂNEAS PARA O TARGET DE ESCOLHA);
-MUITO FÁCIL USO;
-OS REAGENTES ESTÃO EM TABLETES;
-3 ½ PARA O ENRIQUECIMENTO;
-DETECÇÃO: 1UFC/25g DO ALIMENTO;
-ALTA ESPECIFICIDADE.
-(POLYMERASE CHAIN REACTION)
ETAPAS EXTERNAS
1 – PREPARAÇÃO DO DNA
ASPECTOS QUE DEVEM SER OBSERVADOS:
- 1º
-Salmonella:
Protocolo padrão (TSB, Água Peptonada, Caldo
Lactosado) - interferência química
Regrow: BHI
-E. coli:
Protocolo padrão
Exceção: Carnes – (não há a necessidade de fazer o
regrow)
-L. monocytogenes ou sp:
1-Caldo LEB (24hs)
2-Mops Bleb (24hs)
- 2º
(Lise celular) – Gram +
ETAPAS INTERNAS
2 – AMPLIFICAÇÃO
3 – DETECÇÃO
RIBOPRINTER
CARACTERÍSTICAS
-É UM LABORATÓRIO COMPLETO DE TAXONOMIA
BACTERIANA (IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO);
-RNA BACTERIANO;
-FINGERPRINTING;
-COMPLETAMENTE AUTOMATIZADO;
-CAPACIDADE SIMULTÂNEA DE ANÁLISE PARA 8
BACTÉRIAS;
-COMPARTILHAMENTO DE DADOS;
-8 HORAS PARA OBTENÇÃO DOS RESULTADOS;
-É O ÚNICO EQUIPAMENTO DO GÊNERO QUE IDENTIFICA
E CARACTERIZA;
-O KIT VEM COM TODOS OS REAGENTES NECESSÁRIOS
PARA REALIZAR 42 ANÁLISES;
RIBOTIPAGEM
-Grimont & Grimont 1986;
-Baseia-se no fato de que os genes associados com
o RNAr estão distribuídos ao longo de todo o
cromossomo bacteriano, podendo produzir diferentes
padrões de bandeamento (polimorfismo) quando o
cromossomo é clivado com enzimas de restrição e
hibridização com uma sonda de RNAr.
-Variação de RFLP (Restriction Fragment Lenght
Polymorfism) onde a sonda utilizada para detectar o
polimorfismo é específica para RNAr.
-A seqüência de RNAr pode ser selecionada de modo
a se utilizar uma sonda específica para aquela
espécie bacteriana da análise. Entretanto, algumas
seqüências
de
RNAr
estão
conservadas
em
diferentes gêneros bacterianos. Assim, é possível, por
ex. realizar a ribotipagem de amostras de S. aureus
com uma sonda de RNAr isolada de E. coli.
-Princípio avaliar o polimorfismo do DNA na região
onde está localizado o operon rrn; Composto pelos
genes 16S e 23S, que codificam o rRNA das
bactérias;
-Estes genes são altamente conservados nas
espécies bacterianas o que permite o estudo de
diferenciação das espécies bacterianas;
-rRNA 80% / 2.000 cópias / vida média até 100h;
--No DNA os genes responsáveis pela transcrição
dessas moléculas são organizados em uma única
unidade de transcrição;
-Ordem dos genes é: promotor, 16S, tRNA, 23S e 5S, e
separando cada gene, há seqüências de nucleotídeos
chamadas
de
regiões
espaçadoras
ITS
(Internal
transcribed spacer) – variam muito (valor caracterização
intragenérica)
PASSOS DA TÉCNICA DE
RIBOTIPAGEM NO
RIBOPRINTER
- ETAPA EXTERNA
1 – ISOLAMENTO DO DNA
CROMOSSÔMICO;
HOMOGENIZAR
30L
DUAS DILUIÇÕES
40L TAMPÃO
-INATIVAR AS NUCLEASES E LISE
-CICLOS DE AQUECIMENTO E RESFRIAMENTO
-5 L REAGENTES DE LISE A E B
– RUPTURA DA MEMBRANA DAS
CÉLULAS
-INTRODUZIR AS AMOSTRAS NO
RIBOPRINTER
30L COLOCAR NO CARREGADOR DE AMOSTRAS
ETAPA INTERNA
2 – DIGESTÃO COM ENZIMA (S) DE RESTRIÇÃO;
3
–
PFGE
(PULSED
FIELD
GEL
ELETROPHORESIS);
-Separação: corrida em gel de eletroforese e
separação dos fragmentos pelo peso molecular
4 – SOUTHERN BLOT HIBRIDIZATION
-Transferência: dos fragmentos imobilizados na
membrana de nitrocelulose
-Processamento da membrana: os fragmentos do
DNA serão expostos a um tratamento químicoenzimático com uma sonda de DNA e um marcador
quimioluminescente que revelará os fragmentos
hibridizados.
5 – REVELAÇÃO
- As imagens das membranas são capturadas pela
máquina
fotográfica,
inserida
no
sistema
transferidas eletronicamente para o computador.
e
SOUTHERN BLOT HIBRIDIZATION
-A transferência dos fragmentos obtidos pela ação das
enzimas de restrição do gel para uma membrana
(nylon ou nitrocelulose), onde são fixados na mesma
posição, formando uma cópia exata do arranjo original.
-Após a fixação a membrana é colocada em contanto
com uma sonda de rRNA marcada, para que haja
hibridização
da
sonda
com
as
seqüências
complementares presentes nos fragmentos oriundos
do rDNA.
-No computador a imagem de cada gel é tratada e
comparada com o banco de dados para a
identificação;
-Cinco marcadores de peso moleculares são
distribuídos no gel, permitindo que cada coluna,
representando os dados da amostra, seja
normalizada de acordo com um marcador padrão,
baseado na posição e intensidade das bandas;
-Coeficientes de similaridades são então calculados
pelo sistema (posição e peso relativo das bandas);
RESULTADOS
-Todos os isolados que apresentam
coeficientes de similaridades iguais ou
maiores que 0,93% (93%) são classificados
com o mesmo ribogrupo, e os que
apresentam coeficientes de similaridades
igual ou menores que 0,92% (92%) são
isolados diferentes com padrões distintos.
RIBOPRINTER NOS PERMITE:
- IDENTIFICAR AS REGIÕES DE VARIAÇÃO ENTRE AS
ESPÉCIES
-IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES E DISCRIMINAÇÃO DE
SUB-ESPÉCIES;
-TESTES DE ROTINA DE PRODUTOS ACABADOS,
MATÉRIA-PRIMA, EQUIPAMENTOS, MEIOS E PESSOAS
ETC.
DESVANTAGEM PRINCIPAL:
-ALTO CUSTO DOS KITS;
-DISPONIBILIDADE DO EQUIPAMENTO NO BRASIL;