Universidade Estadual do Ceará – UECE
Centro de Ciências da Saúde - CCS
Curso: Ciências Biológicas
Disciplina: Bioquímica
Professor: Luís Flávio
ELETROFORESE
(Em gel de agarose)
Elitha Gardênia Paulino
Stela Mirla Acácio
Fortaleza
2010
Conceito
“Eletroforese em gel: é uma técnica de
separação de moléculas que envolve a
migração de partículas em um determinado gel
durante a aplicação de um potencial elétrico.
As moléculas são separadas de acordo com a
sua carga elétrica e seu peso molecular, logo
as de menor massa irão migrar mais
rapidamente que as de maior massa”.
A eletroforese normalmente é utilizada para
separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.
Breve Histórico...
•
Inicialmente proposta por Arne Teselius (1937).
• A eletroforese era técnica empregada para visualização
de proteínas com suas diferenças de comprimento de
fragmentos de aminoácidos e cargas elétricas.
•
Atualmente, o uso desta técnica é comum também para
estudos com ácidos nucléicos (Brown 1998; Farah
2000), na visualização de material genético (ácido
desoxirribonucléico e ribonucléico, DNA e RNA).
Arne Tiselus
Prêmio Nobel de
Química em 1948
Princípios da Eletroforese
O princípio da eletroforese utilizada
para separação de DNA, baseia-se na
carga total negativa do DNA (dada
pelos oxigênios do grupamento
fosfato). Assim, fragmentos de DNA
obtidos da técnica de PCR, podem
ser separados pela aplicação de uma
voltagem. Ao final do processo, as
cadeias de DNA estarão próximas ao
pólo positivo.
Princípios da Eletroforese
1.Separar partículas por diferença de carga
e massa
2.Aplicaçao de corrente elétrica sobre o gel
3.Isolar fragmentos de DNA, RNA e
proteínas
Equipamentos
•Cuba Eletroforética
•Fonte de eletricidade
•Suporte para o gel
•Pentes
•Pipetas
Equipamentos
Equipamentos
Gel de Agarose
• Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha.
• Não-tóxico.
• Fácil de preparar.
• Possuem ampla capacidade de separação,mas baixa
resolução.
• Dependendo da concentração podem separar
fragmentos de DNA de 200 a 50.000 bp, via eletroforese.
• Custo elevado.
• Ao solidificar, após o aquecimento, os longos
filamentos de agarose formam uma matriz (malha) que
serve de "peneira" de separação de fragmentos de DNA.
•
•
Gel de Agarose
Alguns fatores determinam a migração
do DNA através do gel de agarose:
•
a) tamanho da molécula de DNA
b) concentração da agarose
c) conformação do DNA
(formas circulares ou lineares)
d) a presença de brometo de etídio no gel
e) voltagem aplicada
f) tipo de agarose
g) tipo do tampão de eletroforese
Soluções e Reagentes
•
Tampão
O gel é submerso em um tampão que possui
íons para a corrente passar e também para
manter o pH mais ou menos constante.
a) TAE (Tris-acetate-EDTA electrophoresis buffer –
Tampão de eletroforese-Tris-acetato-EDTA)
b) TPE (Tris-phosphate-EDTA lectrophoresis buffer
Tampão de eletroforese-Tris-fosfato-EDTA)
c) TBE (Tris-borate-EDTA electrophoresis buffer
Tampão de eletroforese-Tris-borato-EDTA)
Soluções e Reagentes
• Tampão de carregamento (loading
buffer)
É uma solução composta de azul de bromofenol (e/ou
xileno cianol ) e glicerol, é misturado às amostras
antes de carregar o gel e possui três finalidades:
1) aumentar a densidade da amostra
2) adicionar cor às amostras
3) simplificar o processo de carregamento
Soluções e Reagentes
•
Coloração do gel:
1) Brometo de etídio
O brometo de etídio intercala-se com a molécula de
DNA a cada 2,5 bp do fragmento, após sua inserção
esse exerce uma ligação do tipo Van der Waals. A
radiação UV é capaz de estimular essa ligação entre o
DNA e o corante tornando a molécula ou banda visível
no gel através de um dispositivo de transiluminação.
Como o brometo de etídio se intercala no DNA, esta
substância tem um poderoso efeito mutagênico e,
possivelmente pode ser cancerígeno ou teratogênico.
Marcadores de peso
molecular
A distância que o fragmento percorre a partir do ponto de
.
aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos
de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses
fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular),
misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e
eqüidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel
no início do processo.
Montando a Eletroforese
•Preparação do Gel de Agarose
1. Para 100mL de gel, pesar 0,8g de agarose.
2. Adicionar 100mL de TAE 1X.
3. Fundir a solução no microondas até homogeneizar
(sugestão: 2 a 2,5 min, potência 7).
4. Enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte
de gel, selando as laterais com fita crepe ou na própria cuba.
5. Acrescentar 5μL de Brometo de Etídeo (10mg/mL) e misturar
com agitação leve.
6. Despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas.
7. Colocar o pente da espessura desejada no suporte.
8. Esperar a solução solidificar.
9. Colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese.
Montando a Eletroforese
•Preparação das Amostras (DNA)
1. Extrair 3μL da amostra de DNA.
2. Homogenizar com 1μL de tampão de corrida 5X
(Loading Buffer).
3. Aplicar as amostras nos poços.
4. Reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida
(Ladder-1Kb).
Montando a Eletroforese
•Montar a Cuba Eletroforética
•Adicionar o gel, previamente preparada
•Adicionar tampão TAE 1X até cobrir a
superfície do gel.
•Adiciona as amostras a serem separadas
•Ajustar a voltagem desejada(média 80v)
e ligar a cuba
Eletroforese em gel
• Eletroforese em gel de poliacrilamida:
a
poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros,
acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula
linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T".
Misturando essas duas moléculas, temos a formação de
uma "rede".O gel de poliacrilamida tem maior
capacidade de resolução e é mais efetivo para separar
pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp – pares de
base).
•
Eletroforese Desnaturante:
normalmente feita
em gel de agarose, inclui um agente desnaturante
(normalmente uréia), o que ajuda a tornar a separação
melhor entre moléculas que apresentam diferenciação
em suas estruturas secundárias.
Eletroforese em Gel
• Eletroforese capilar:
Funciona como a eletroforese
normal, porém o gel e a amostra estão dentro de um capilar, e a
amostra é detectada automaticamente por um detector. Isso
possibilita a automação do processo. Essa é a eletroforese
atualmente utilizada em seqüenciadores de DNA.
Visualização após a
Eletroforese
.
Correndo
o DNA em um gel tratado com EtBr e
olhando sob UV podemos ver as bandas de DNA.
Visualização após a
Eletroforese
.
Visualização após a
Eletroforese
.
Visualização após a
Eletroforese
.
Visualização após a
Eletroforese
.
SYBR Green > Molecular Probes 1995
Revolucionou a detecção de DNA em géis.
A intensidade da fluorescência do SYBR
Green é aumentada em 100X quando se
liga ao DNA. Consegue-se ver picogramas
de DNA.
Junto a sua sensibilidade superior o SYBR
Green tem outras vantagens sobre o EtBr:
- É muito menos mutagênico,
- Pode ser adicionado diretamente à
amostra antes da eletroforese.
“O homem que à ciência quer dedicar
seu tempo e amor, tem pelo menos três
certezas na vida: primeira, que morrerá
como todo mundo; segunda, que não
ficará rico, como quase todo mundo e,
por fim, que se divertirá muito, como
pouca gente”.
Prof. Dr. Newton Freire.
Departamento de Genética UFRS.
OBRIGADA!!!
diponível em: www.mirla.com.br