A Genética Molecular
em Análises Clínicas
2001/2002
Prof.Doutor José Cabeda
Genética
Genética Molecular
em Medicina Transfusional
Técnicas de estudo de mutações
desconhecidas
2001/2002
Prof.Doutor José Cabeda
Genética
Técnicas de estudo de mutações
desconhecidas


Métodos Baseados No Tm
 Melting Profiles and GC clamps
 DGGE
• Perpendicular
• Paralelo
 CDGE
 TTGE
Métodos Baseados na conformação
 SSCP
 HA
 CSGE
“Melting Profiles”





Vários domínios de fusão
As moléculas de DNA fundem por etapas
Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel
Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm
Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total
Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis (DGGE)


Gradiente de desnaturação
 Químico
 Temperatura
O gradiente pode ser:
 Perpendicular ao
campo eléctrico
 Paralelo ao campo
eléctrico
Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis (DGGE)
heteroduplexes
homoduplexes
Constant Denaturing Gel
Electrophoresis (CDGE)
Temporal Temperature Gradient
Gel Electrophoresis (TTGE)



Não existe um gradiente no gel,
em cada momento da corrida
Existe uma temperatura
crescente ao longo da corrida
Em cada momento, a migração
em cada molécula depende de
esta já ter atingido ou não
algum domínio de fusão
Temporal Temperature Gradient
Gel Electrophoresis (TTGE)
Vantagens


Mais fácil de fazer os
geis
Mais reprodutível de
gel para gel
Desvantagens

Mais difícil de acertar
a gama de Tm
Métodos baseados na
conformação


Conformação do dsDNA
 não depende da sequência
 A conformação de homodupletos é diferente da
dos heterodupletos
 A conformação dos heterodupletos depende da
sequencia de “mismatch”
Conformação do ssDNA
 depende da sequência (forma zonas de dupleto
intramolécular, dependentes da sequência)
Single Strand Conformation
Polimorfism (SSCP)





dsDNA é desnaturado
dsDNA é diluido
Renaturação rápida
Corrida em condições semidesnaturantes e a temperaturas
fixas
Resultado depende muito de:
 Temperatura de corrida
 Concentração de
desnaturante
 Presença de certos
químicos (ex: glicerol, etc)
WT1
mutantes
WT2
Heteroduplex Analysis (HA)



Heterodupletos causam
 Distorção na conformação
 Migração no gel mais lenta
Heterodupletos podem existir por:
 Co-amplificação por PCR de heterozigotos
 Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR
Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e
WT+M
Heteroduplex Analysis (HA)
Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp)
 Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou
DEM) aumenta a sensibilidade da HA
 A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente
semi-desnaturante que aumenta a resolução do
HA

Conformation Sensitive Gel
Electrophoresis


Principio:
 Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a
capacidade de mutações pontuais produzirem alterações
conformacionais.
Método:
 Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina
e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante)
 Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”,
aumentando a força do gel e tamanho dos seus poros
 Utilizar fragmentos com 300-800 bp
Hibridização
desnaturar
Hibridização
Adicionar sonda
Hibridização
Hibridização
Adicionar substracto
Dot-Blot
Variações
Hibridização em microplaca
 hibridização reversa

DEIA
(hibridização reversa em microplaca)
(detecção com anti-dsDNA)
Inno-Lippa
Hibridização em filtro
 Várias sondas por filtro dispostas em tiras
(tipo código de barras)
 Hibridização reversa
 Marcação no produto do PCR

Resultados do INNO-LIPA
MEIA
Southern
Blot
Northern Blot

Semelhante ao Southern
 Utiliza RNA e não DNA
 Não utiliza reacções de restrição