Eletroforese em Análise de
Ácidos Nucleicos
Profa. Dra. Rejane da Silva Sena Barcelos.
Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos
Eletroforese em gel
Técnica de separação de moléculas que envolve a
migração de partículas em um determinado gel
durante a aplicação de uma diferença de potencial.
As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho,
pois as de menor massa irão migrar mais
rapidamente.
Em alguns casos, o formato da moléculas também influi, pois
algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel.
A eletroforese normalmente é utilizada para separar
proteínas e moléculas de DNA e RNA.
Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos
A análise de DNA por eletroforese é uma das técnicas
fundamentais nos laboratórios de pesquisa e de
diagnóstico.
O princípio é baseado no fato da molécula de DNA possuir
carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e
quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel
submetida a um campo elétrico, migra em direção ao
pólo positivo (anôdo).
A velocidade da migração depende do tamanho da molécula.
Por isso em um dado momento da eletroforese
moléculas de tamanhos distintos se encontram em
diferentes pontos da matriz.
Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos
Matriz - agarose ou poliacrilamida –
Depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se
pretende separar e visualizar.
Devido à diferença no tamanho dos poros dessas matrizes:
Gel de agarose para a separação de fragmentos que
variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases)
Gel de poliacrilamida para separação de fragmentos
pequenos, de até 1kb.
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CUIDADOS:
Poliacrilamida em solução - neurotóxica.
A preparação do gel exige certa cautela.
É mais laboriosa, requerendo a mistura de
componentes adicionais à poliacrilamida para ajudar
na polimerização e mais tempo para que a
polimerização ocorra.
Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos
CUIDADOS:
Agarose - mistura de um tampão e agarose, não tóxica.
Polimerização é mais rápida e o gel pode ser reciclado após o
uso, isto é, pode ser reutilizado na elaboração de
outros géis.
Usado como método analítico ou preparativo, isto é, quando o
fragmento de DNA é recuperado e purificado a partir do
gel.
Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos
CUIDADOS:
Agarose Desvantagem: Coloração com brometo de etídio (EtBr) substância mutagênica.
É necessária a utilização de transiluminador de luz ultravioleta.
Gel de Agarose
Solução Tampão
Pente
Poço
Gel agarose
Gel de Agarose
Gel de Agarose

Agarose

É um polissacarídeo extraído de algas marinhas,
formado por resíduos de D e L galactose unidos por
ligações glicosídicas α (1-3) e β (1-4), é um material
gelatinoso e semelhante a gelatina incolor.

Forma uma rede que segura as moléculas durante a
migração.

Separa moléculas com diâmetro igual ou superior a
10 nm.
Gel de Agarose

Rede é formada pela solidificação de um polímero
linear com filamentos finos entrelaçados

Agarose: Colóide natural
Gel de Agarose
A agarose é dissolvida em água fervendo e forma um
gel quando esfria.
Formação de duplas hélices que se juntam
lateralmente.
Gel de Agarose
Gel de Agarose

Um fragmento de DNA possui uma mobilidade eletroforética
que decresce em proporção ao logaritmo do seu tamanho
em pares de bases.

Fragmentos maiores movem-se mais lentamente.

Essa proporcionalidade depende:
- concentração do gel de agarose
- composição do tampão de corrida
- condições eletroforéticas

Diferentes concentrações de agarose permitem uma
separação eficiente de diferentes tamanhos de DNA.
Gel de Agarose

Tamanho dos poros do gel de agarose:
diretamente proporcional ao tamanho do
fragmento que se deseja separar.

O tamanho do poro, ou a porosidade do gel é definido
pela concentração do gel.



Quanto menor for a concentração do gel maior será a
porosidade e, portanto, maior o fragmento de DNA que
poderá ser separado
Quanto menor a concentração do gel, mais frágil ele se torna.
Geralmente se trabalha com géis de agarose de 1 a 1,5%,
dependendo do fragmento de DNA esperado.
Gel de Agarose

Concentração: dada como peso de agarose
por volume de água.
Géis a 1%:
poros em torno de 150 nm
Géis a 0,16%:
poros em torno de 500 nm
Fatores que afetam a migração

Tamanho da molécula

Concentração do gel


Define o tamanho dos poros

Conformação do DNA
Força elétrica aplicada

Voltagem (Volts)

Corrente (Ampéres)

Força (Watts)

Presença de corantes intercalantes

Composição do tampão
Gel de Agarose

SOLUÇÕES E REAGENTES

Tipos de tampões:
a) TAE (Tris-acetate-EDTA electrophoresis buffer –
Tampão de eletroforese-Tris-acetato-EDTA)
b) TPE (Tris-phosphate-EDTA electrophoresis buffer –
Tampão de eletroforese-Tris-fosfato-EDTA)
c) TBE (Tris-borate-EDTA electrophoresis buffer –
Tampão de eletroforese-Tris-borato-EDTA)
Gel de Agarose


Tampão de carregamento (loading buffer):

Misturado às amostras antes de aplicar no gel.


Finalidades:
1) Aumentar a densidade da amostra

2) Adicionar cor às amostras
Coloração do gel:

Brometo de etídeo (agarose e poliacrilamida)
Aplicação das amostras:
Antes da aplicação, as amostras de DNA deverão ser
misturadas a um tampão de amostra.
Contém corantes e reagentes de alta densidade
(sacarose, glicerol ou ficol).
Asseguram que a amostra de DNA entre no poço pela força
da gravidade.
Corantes azul de bromofenol e o xileno cianol, facilitam a
aplicação da amostra no gel (acrescentam cor na
amostra) e auxiliam no monitoramento da corrida, já
que apresentam velocidade conhecida durante a
migração na matriz em direção ao pólo positivo.
Tamanho dos fragmentos
Estimativa visual do tamanho dos fragmentos de DNA é
necessário aplicar em um dos poços o marcador de
massa molecular (ladder).
Ladder é uma mistura de diversos fragmentos
de DNA de tamanhos e concentrações
conhecidos, gerados a partir da digestão de
plasmídeos (DNA circular -bactérias) com
enzimas de restrição.
Permite inferir, por comparação, o tamanho dos
fragmentos presentes na amostra analisada.
Ladder 1kb -13 fragmentos (0,3 a 10 kb)
Ladder 100bp -14 fragmentos (0,1 a 5 kb)
Gel de Agarose

Corantes:

EtBr - brometo de etídeo



Intercala-se com a molécula de DNA a cada 2,5 bp do
fragmento. Após sua inserção esse exerce uma
ligação do tipo van der Waals.
Radiação UV - capaz de estimular essa ligação entre
o DNA e o corante tornando a banda visível no gel
através de um dispositivo de transiluminação.
Brometo de etídeo é mutagênico!!!
Gel de Agarose
A intensidade de fluorescência emitida é proporcional à
concentração de DNA presente na amostra.
Pode ser utilizado de 3 diferentes formas:
- aplicado diretamente no gel
- no tampão da amostra
- após a corrida quando o gel é
submergido em solução de EtBr.
EtBr - brometo de etídeo
Transiluminador
VDS
Gel de Agarose
Gel de Agarose
Corantes:

SYBR Green I

Corante intercalante que pode detectar até 20pg
de DNA-dupla fita


Brometo: 1 a 10 ng de DNA, no mínimo, para dar sinal
fluorescente
Sensibilidade 50 a 100 vezes maior
que o brometo

Menos mutagênico
Gel de Agarose
SYBR Green I
Gel de Poliacrilamida
Separação de moléculas e DNA.
Forma uma malha com poros que permite a passagem das
moléculas e sua separação de acordo com suas
características.
A poliacrilamida é uma mistura de polímeros, acrilamida e
bisacrilamida.
A acrilamida é uma molécula linear, enquanto a bisacrilamida
tem forma de "T". Misturando essas duas moléculas,
temos a formação de uma "rede".
Diferentes concentrações dessa moléculas permitem a
criação de diferentes gradientes de separação.
Gel de Poliacrilamida
Preparo gel de poliacrilamida: misturar as duas substâncias
formadoras nas concentrações desejadas, colocá-las
em um suporte de vidro, e adicionar Temed e S208,
que atuam como catalizadores da polimerização.