Fabiane Maria Lima Sousa
Mestranda PPGZ-UFC
Orient.: Prof.: Arlindo Moura
 A digestão é necessária para que todas as partes da
proteína fiquem uniformemente expostas à
dissociação e ionização, e para aumentar a eficiência
desses processos.
 As bandas/spots protéicos correspondentes à proteína
de interesse serão:
Excisadas
2. Descoradas
3. Submetidas à digestão enzimática
1.
Imagem gerada pelo PDQuest: Master gel
 Proteases normalmente utilizadas:
o Quimotripsina
o Pepsina
o Carboxipeptidases
o Aminopeptidases
o Tripsina ou uma combinação delas
Capacidade
Previsibilidade
Disponibilidade
Cuidados no procedimento
 Manter o gel umedecido com água destilada para evitar
o ressecamento.
 Deve-se usar reagentes de boa qualidade e procedência
conhecida.
 Durante os procedimentos de corte e digestão, é
importante o uso de luvas, jaleco de mangas compridas,
e, se possível, touca e máscara, para evitar
contaminações, a principal é a queratina humana.
Etapas do procedimento
 Excisão ou corte dos spots
o Spot no gel, é cortado no centro e dividido em
pedaços menores.
o Existem os métodos manuais (tesoura, bisturi ou
gilete), e existe um método computadorizado
(spot picker).
Excisão manual com bisturi
Método computadorizado (Spot picker)
 Lavagem do gel
o Solução de acetonitrila/bicarbonato de amônio
o Desidratado o gel com acetonitrila
o Remover a acetonitrila e secar completamente os géis no
Speed Vac.
 Digestão com tripsina
o Solução de tripsina diluída será distribuída de forma a
cobrir os pedaços de gel.
o Extração dos peptídeos (por meio de lavagens)com ácido
fórmico 5% ou TFA 5%/ acetonitrila 50%.
o Concentrar as amostras .
Gel separation – 1D or 2D
Trypsin
Digest
Excise
Spot
Protein
Peptides
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