Yvana Cristina Jorge
Profª. Drª. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira
Elementos de Microscopia e Microanálise
Técnica de Hibridização in situ
Permite a detecção de sequências de DNA e RNA em
preparações citológicas e cortes histológicos
Usada pela 1ª vez no mapeamento físico
de genes
Gall e Pardue (1969): sondas de RNA ribossomal
ISH
As sondas são sequências de nucleotídeos
complementares desenvolvidas a partir de
segmentos conhecidos do DNA ou RNA que
se deseja identificar
As sondas podem estar associadas a
moléculas radioativas, fluorescentes
ou biotiniladas
Tipos de hibridização
In vitro
Suporte sólido, em soluções
Southern blotting – DNA
Northern blotting - RNA
In situ
Tecidos e preparações citológicas
Princípios
Sensibilidade: depende do acesso da sonda ao material-alvo.
Resolução: depende do diâmetro celular e do método usado para
marcação e detecção da sonda.
Especificidade: depende
da
estringência
da lavagem e
da
extensão similar entre a sonda e a sequência-alvo.
Segurança: sondas não-radioativas são mais seguras que as
radioativas.
Etapas da Hibridização in situ
1. Preparação da sonda
•
Sondas de DNA dupla cadeia: podem ser sintetizadas por nick
translation, random priming ou PCR na presença de nt
marcados.
•
Sondas de DNA cadeia única: sintetizadas por PCR.
•
Sondas de oligonucleotídeos: ocorre com a incorporação de nt
marcados.
•
Sondas de RNA: uso de RNA polimerase purificada que
transcreve determinadas sequências a partir de um sítio de
iniciação. Geralmente essa sonda é clonada usando-se um
plasmídeo.
1. Preparação da sonda

Comprimento da sonda: Sondas muito longas podem formar
sinais fracos devido a baixa taxa de penetração. 50 a 150 pb
resultam, geralmente, em bons sinais.

Marcação da sonda:
 Marcação radioativa: eficiência da síntese pode ser
monitorada; radioisótopos são facilmente
incorporados durante a síntese (H3, P32 e S35).
 Marcação não radioativa: rapidez na visualização, alta
estabilidade da sonda, segurança, melhor preservação
da morfologia do tecido, facilidade de execução,
menor custo e desperdício.
Interação
anticorpo,
entre
biotina-avidina
sendo
que
ou
alguns
com
algum
fluorocromos
(Fluoresceína ou rodamina) podem ser usados para
identificar sítios de hibridização.
2.Preparação do material: essa etapa é variável porque depende
da natureza do material e do tamanho e tipo de sonda a ser
utilizada.
•
Cultura de tecidos: as células devem crescer diretamente
sobre as lâminas ou as células devem ser pingadas.
•
Fixação: deve ser suficiente para prevenir a perda do ácido
nucléico (paraformaldeído 4% e glutaraldeído 4%).
•
Embebição e seccionamento: o pedaço de tecido pode ser
congelado ou embebido em parafina. Importante para a
preservação do tecido.
3. Pré-tratamento: Essa etapa é necessária para aumentar a
eficiência da hibridização e/ou diminuição da formação de
ligações não-específicas.
Pepsina
RNAse
Ácido acético
 Se a sonda for cadeia dupla, ela deve ser denaturada a 70ºC
em formamida.
4. Hibridização: para cada caso se tem um protocolo.
5. Lavagem pós-hibridização: para remoção do excesso de
sonda.
6.
Detecção
da
sonda:
depende
do
tipo
de
marcação
incorporada na sonda:
Radioativa
Autoradiografia
Nãoradioativa
Direta
Indireta
Direta
Indireta
A sequencia é marcada com
A sonda é marcada com biotina e,
biotina que é detectada pela
utiliza-se
ligação com a avidina. Depois,
biotina. Após, usa-se um anticorpo
utiliza-se
secundário.
uma
enzima
ou
uma
anticorpo
anti-
fluorocromo para a visualização.
Policlonal de cabra
Fosfatase alcalina ou peroxidase
IgG conjugada a
Fluoresceína
Fluoresceína ou Rodamina
Artefatos da técnica
Background (sondas radioativas): preparação inadequada da emulsão e
o posicionamento da lamínula.
Background (sondas não-radioativas): ligações não específicas.
Hibridização não eficiente: degradação da sequencia-alvo; tamanho e/ou
concentração baixa da sonda; estringência da hibridização ou lavagem;
tipo de tratamento e fixação.
1986
Pinkel et al.
Uniram a técnica de hibridização
com imunofluorescência
FISH
Aplicações
Usa corantes fluorescentes ligados a sonda
Aberrações cromossômicas
Mutagênese
Diagnóstico de câncer
Pré-natal e pré-implantação
3 categorias de sondas:
1. Sondas que hibridizam locus específicos ou sequências únicas:
-Sequências únicas de DNA amplificado por PCR ou vetores
biológicos.
-Resultam em sinais discretos em cromátides irmãs de metáfases e
dois sinais no núcleo interfásico.
2. Sondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas:
-Sondas pericentroméricas específicas ou sequencias repetitivas
alfa-satélite, beta-satélite e sondas de satélites clássicos e, sondas
teloméricas
-Sinal nítido e brilhante
3. Sondas que hibridizam sequências cromossômicas múltiplas:
-Coquetel de sequências únicas homólogas a sequências de DNA
abrangendo o comprimento de uma banda ou cromossomo alvo.
-Seu uso em núcleos interfásicos é limitado pela ausência de um
sinal distinto.
Sondas centroméricas
Sonda de sequência única
FISH aplicado ao diagnóstico
Verde: cr. 17
Laranja: Her-2
1q41
1q43
Hibridização in situ Fluorescente Multialvo
oPossibilita
a
visualização
de
várias
sequências
diferentes
simultaneamente em cromossomos metafásicos e núcleos interfásicos.
oVárias sondas complementares à diferentes sequencias-alvo numa
mesma hibridização.
Aplicações
Citogenética do câncer
Determinação sexual
Sonda painting
Hibridização Genômica Comparativa
oIdentificação de anomalias cromossômicas e de sequências
amplificadas e deficientes.
oPermite a análise em todo o genoma de uma só vez.
--Alterações genéticas complexas e aneuploidias em tumores;
--Translocações e inversões específicas em certos tipos de
leucemia.
1. O DNA genômico de interesse e o DNA normal são cortados pelas
mesmas enzimas de restrição e marcados de forma a serem
detectados por fluorocromos diferentes.
2. Numa proporção de 1:1, os DNAs são co-hibridizados sobre uma
lâmina com métafases de tecido normal.
3. A visualização dos diferentes sinais permite a comparação entre os
DNAs em relação às metáfases normais, fornecendo um número
comparativo de aumento ou perda de DNA:
Oncogenes
Genes
supressores
Metáfase normal
DNA teste
DNA controle
Hibridização
Marcação
1 ou mais cromossomos inteiros
Vários tipos
de
fluorocromos
Metáfase
Detecção de alterações cromossômicas
Rearranjos complexos
Diagnóstico pré-natal
Estudos de evolução comparativa
Cariotipagem espectral
1996
Schrock et al.
Cromossomos humanos
Cariotipagem espectral
Permite a identificação de todos os cromossomos inteiros com diferentes
cores.
Necessita de uso combinado da espectroscopia de Fourier, analisador de
imagens e microscópio óptico.
Usa simultaneamente 24 diferentes sondas marcadas com nt conjugados
a 5 tipos de fluorocromos:
Cy2
SG
Cy3
TR
Cy5
O computador processa uma determinada cor para cada par
cromossômico, facilitando a interpretação.
Aplicações
•Identificação de alterações cromossômicas
Rearranjos estruturais
Cromossomos marcadores
Genética Clínica
Genética do Câncer
Biologia evolutiva e comparativa