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Cinética Enzimática
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Cinética das Reações Bioquímicas
As células vivas dos organismos heterotróficos e dos organismos autotróficos (na ausência
de luz) obtêm a energia de que necessitam a partir da oxidação dos poliosídios de reserva a
CO2 e água.
Esse conjunto de reações, assim como, as reações de síntese das macromoléculas, só é
possível devido à intervenção dos catalisadores bioquímicos as enzimas.
enzimas
Todas as enzimas são proteínas globulares e catalisadores eficientes.
Catalisadores
Energia de ativação necessária para iniciar um processo químico pode ser fornecida
pela elevação da temperatura que aumente a agitação molecular.
Em Bioquímica, a temperatura dos sistemas não pode ultrapassar os valores
compatíveis com a vida dos organismos (aquecimento ⇒ desnaturação das
proteínas).
Catalisadores bioquímicos ⇒ função de baixar a energia de ativação necessária à
reação e permitir que a reação ocorra em velocidade muito mais elevada.
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Centro ativo ou sítio ativo
É constituído pelo conjunto de aminoácidos que entram em contato com o substrato.
Compreende o local de fixação: que se combina com o substrato por ligações fracas;
e o centro catalítico: que atua sobre o substrato levando-o a sofrer a reação
química.
A conformação do local e fixação se modifica em conseqüência da ligação ao
substrato ⇒ substrato induz a alteração da conformação.
Nas enzimas que atuam através de um cofator (metal; grupo prostético ou
coenzima), essa estrutura se encontra ligada na vizinhança do centro catalítico.
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Velocidade da Reação enzimática
A velocidade de uma reação enzimática é, em geral, obtida pela medida da quantidade de
produto (ou produtos) formado (s) por unidade de tempo.
S + E
P + E
S = substrato; E = enzima; P = produto
A determinação experimental da velocidade da reação é feita recolhendo do meio
reacional, a intervalos regulares de tempo, alíquotas da solução.
A velocidade de reação num tempo (t) é:
v=
d [P]
dt
A velocidade pode ser medida, também, a partir do decréscimo da concentração de
substrato:
v=
d [S ]
dt
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Representação gráfica:
Quantidade de
produto formado
α1
vo = tg α o
v1 = tg α 1
velocidade inicial de uma reação
enzimática
velocidade num instante t 1
αο
t1
Tempo
Até certo ponto da reação, a variação é linear.
É vantajoso medir a velocidade no início da reação, quando pouco substrato foi
transformado e a velocidade inversa é desprezível.
A inclinação é então máxima, o que permite ter a velocidade inicial da reação (v0).
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A velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima
[P]
Velocidade de uma reação enzimática
em presença de quantidades crescentes
de enzima
(E2 = 2E1; E3 = 3E1; etc..)
E4
E3
E2
4x
3x
2x
1x
E1
t1
v
t2
A velocidade de
formação de produto
(dp/dt) é constante
para E1 e E2 até o
tempo t1
Tempo
[P ] 

 v =

t1 

Variação linear de velocidade inicial
de uma reação enzimática com a
concentração de enzima
E4
E3
E2
E1
[E]
Na determinação de
produto formado em
intervalo de tempo
mais longo, a resposta
não será linear em
todas as faixas de [E]
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Fatores que Influenciam a Atividade Enzimática
Vários fatores influenciam a atividade de uma enzima. Os mais importantes são a
temperatura, pH, concentração de substrato e a presença ou ausência de inibidores.
A velocidade da maioria das reações químicas aumenta
quando a temperatura aumenta. Moléculas se movem
mais lentamente a baixas temperaturas do que a altas
temperaturas e, portanto, muitas podem não ter
energia suficiente para promover a reação química.
Para as reações enzimáticas, entretanto, elevações
além de certa temperatura reduz drasticamente a
velocidade de reação. A temperatura ótima para a
maioria das enzimas se situa entre 35 e 40ºC.
A redução da velocidade de reação acima da
temperatura ótima é devida à desnaturação das
enzimas, ou seja, a perda de sua estrutura
tridimensional característica. A desnaturação de uma
proteína envolve o rompimento de ligações de
hidrogênio e outras ligações não covalentes.
Velocidade da reação
Temperatura
0
10
20
30
40
50
60
Temperatura (ºC)
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pH
A maioria das enzimas tem um pH ótimo no qual sua atividade é máxima. Acima ou abaixo
deste valor de pH a atividade enzimática, e portanto a velocidade de reação, diminui.
Atividade Enzimática
Quando a concentração de H+ (pH) no meio é drasticamente alterada, a estrutura
tridimensional da proteína também é alterada. Mudanças extremas na concentração de
ácidos (ou bases) modificam a estrutura tridimensional de proteínas porque o H+ (ou OH-)
compete com o hidrogênio nas pontes de hidrogênio e ligações iônicas presentes na
estrutura da enzima, resultando na sua desnaturação.
4
6
8
10
pH
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Concentração de Substrato
Existe uma taxa máxima na qual certa quantidade de enzima pode catalisar uma reação
específica. Apenas quando a concentração de substrato é extremamente alta, esta taxa
máxima pode ser alcançada.
Sob condições de alta concentração de substrato, a enzima está em saturação, isto é, seus
sítios ativos estão todos ocupados por moléculas de substrato ou produto. Nesta condição,
um aumento na concentração de substrato não afetará a taxa de reação porque todos os
sítios ativos já estarão sendo utilizados. Em condições celulares normais, as enzimas não
estão saturadas com o substrato. Em um determinado tempo, algumas das moléculas de
enzima poderão estar inoperantes por falta de substrato, assim, a velocidade de reação é
influenciada pela concentração de substrato.
Inibidores
Uma forma efetiva de controlar o crescimento de um microrganismo, por exemplo, é
controlar suas enzimas.
Qualquer substância que reduza a velocidade de uma reação enzimática pode ser
considerada como inibidor.
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Cinética Enzimática
Na reação enzimática se forma um complexo transitório entre enzima e substrato.
A reação catalisada enzimaticamente se processa
em duas etapas:
E+S
ES
k2
A enzima se liga reversivelmente ao substrato
formando um complexo enzima-substrato (ES)
O produto é liberado e a enzima volta à forma
livre podendo, então, se ligar a outra molécula
de substrato.
k1
k
ES →
E+P
3
E +S
k1
k
ES →
E + P
3
k2
O estudo das reações enzimáticas se baseia em medidas de velocidade da reação catalisada.
Velocidade de uma reação ⇒ quantidade de produto formado em um tempo determinado.
Velocidade inicial de uma reação ⇒ medida em tempos suficientemente curtos para que no
máximo 5% do substrato sejam transformados em produto.
Em uma reação enzimática típica, a 1ª fase ocorre a velocidades muito maiores do que a
2ª fase. Equações de velocidade para estas fases são:
v1 = k1 [E ] [S ]
v3 = k 3 [ES ]
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E+S
k1
ES

k3
E+P
k2
A medida real da velocidade da reação, ou seja, a medida da velocidade de formação do
produto é igual a v3, que é a etapa mais lenta e limitante do processo.
Nas reações enzimáticas, a concentração de enzima é, normalmente, muito menor que a
concentração de substrato.
Um equilíbrio entre E, S e ES (com concentrações definidas e constantes de cada espécie)
se estabelece muito rapidamente.
Tendo ocorrido a formação de ES, se inicia a segunda parte da reação enzimática, aquela
que efetivamente forma o produto, com uma velocidade proporcional à concentração de
ES.
O fato de ES estar sendo consumido na formação do produto não provoca diminuição da
sua concentração, uma vez que há excesso de substrato para se combinar com a enzima
liberada quando se forma o produto.
Esta situação se mantém por algum tempo (tempo inicial): contínua formação do produto e
concentrações estáveis de ES e S.
A pequena e contínua diminuição da concentração de S não é significativa, face ao seu
grande excesso.
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À medida que se aumenta a concentração inicial do substrato, as velocidades de
formação do produto se tornarão cada vez maiores. No equilíbrio da 1ª etapa
existirá cada vez mais complexo ES. Nestas condições haverá a maior concentração
possível do complexo ES; a reação será processada na máxima velocidade possível.
Existirá uma determinada concentração de substrato que provocará a formação de uma
concentração de ES igual à metade da máxima possível. Nestas condições, a velocidade
será, naturalmente, a metade da maior velocidade possível.
Esta concentração definida de substrato é igual à Constante de Michaelis-Menten ou Km.
v
Vmax
b
½ Vmax
a
Km
[S ]
a – cinética de 1ª ordem (velocidade proporcional à concentração de substrato)
b – cinética de ordem zero (velocidade independente da concentração de substrato)
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Variação de velocidade da reação com a concentração de substrato
Teoria de Michaelis-Menten (com um único substrato)
E + S
k3
k1
ES
k2
E + P
k4
E = Enzima
S = Substrato
ES = Complexo enzima-substrato
P = Produto
Propostas
A enzima e o substrato reagem rapidamente para formar o complexo enzima-substrato
(ES)
A fase mais lenta é a formação de produto (P)
Há excesso de substrato (S)
Todas as determinações de produto (P) são feitas no início da reação quando a
velocidade de formação do complexo enzima-substrato (ES) a partir de enzima (E) +
produto (P) é muito pequena e pode ser desprezada ⇒ velocidades iniciais
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Dedução
E + S
k1
ES
k3
E + P
k2
[E ] t = [E ]+ [ES ]
v = k 3 [ES ]
Vmax = k 3 [E ] t
k1 [E ][S ]
Qual a velocidade de formação de [ES] ? ⇒
Qual a velocidade de decomposição de [ES] ? ⇒ k 2 [ES ]+ k 3 [ES ]
Variação de [ES] com o tempo:
d [ES ]
= k1 [E ][S ]−k 2 [ES ]− k 3 [ES ]
dt
Como no estado estacionário [ES] não varia ⇒
k 1 [E ][S ] = (k 2 + k 3 )[ES
[E ][S ] = k 2 + k 3 [ES ]
k1
[E ][S ] = Km [ES ]
d [ES ]
=0
dt
]
k2 + k 3
k1
= Km
Km = Constante de Michaelis ou
Constante de dissociação do complexo ES (Ks)
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É muito difícil quantificar [ES], porém, se sabe que: [E ]t = [E ]+ [ES ] ⇒
Substituindo em : [E ][S ]= Km[ES ]
[S ]([E ]t − [ ES ]) =
[E ] t − [ES ]
k 3 [E ]t =
=
Km
[S ]
[E ] = −[ES ]+ [E ]t
Km [ES]
Km
[ ]
× k3
[S ] ES
k 3 [ES ] + k 3 [ES]
 Km

+ 1 v
V max = 
 [S ]

v =
V max . [S ]
Km + [S ]
Equação de Michaelis-Menten
v = velocidade observada na reação quando a concentração de substrato é [S]
Km = Constante de Michaelis-Menten
Vmax = velocidade máxima da reação. Ocorre quando o substrato está presente em
concentrações de saturação.
A equação de Michaelis e Menten permite, após a determinação experimental das
variáveis v em função de [S], obter o valor de Vmax e calcular Km.
Em geral, os valores de Km estão compreendidos entre 10-2 e 10-8 M.
Atribui-se a Km unidades de concentração.
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Curva de Michaelis-Mentem
Variação da velocidade de reação em função da concentração do substrato
v
Equação de Michaelis-Mentem:
Vmax
c
v =
½ Vmax
b
V max . [S ]
Km + [S ]
a
Km
[S]
Analisando a curva:
a. Quando [S] << Km
v=
Vmax⋅ ⋅ [ S ]
Km + [ S ]
V
v = max ⋅ [S ]
Km
1ª ordem
desprezado
b. Quando v = ½ Vmax
c. Quando [S] >> Km
1
V ⋅ [S ]
Vmax = max
2
Km + [ S ]
v=
Vmax ⋅ [S ]
Km + [ S ]
negligenciável
Km + [ S ] = 2[ S ]
Km = [ S ]
v = V max
Km tem dimensões de
concentração
Ordem zero
não depende da [S]
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Por que determinar Km ?
Km estabelece o valor aproximado para o nível de substrato intracelular.
[S]intracelular << Km ⇒ v seria muito sensível a variações de S (1ª ordem) e o poder catalítico da enzima
seria desperdiçado, pois v << Vmax.
[S]intracelular >> Km ⇒ não há sentido fisiológico pois v não pode exceder Vmax. Quando [S] >> Km; v se
torna insensível a variações de S.
Km é específico para uma dada enzima.
Serve de meio de comparação entre enzimas extraídas de diferentes fontes, mas que catalisam a
mesma reação.
Pode-se determinar se duas enzimas são idênticas ou se são proteínas diferentes que catalisam a
mesma reação.
Variação no valor de Km induzida por um ligante é uma maneira de regular a atividade de uma enzima.
Se Km determinada “in vitro” for diferente da determinada em condições fisiológicas, isto pode
indicar a falta de um efetor. Vários efetores podem ser testados para a identificação de quais atuam
como inibidores ou ativadores.
v
Conhecendo-se o valor de Km pode-se determinar Vmax
que é função da [E]total
Utilizando [S] >> Km determina-se Vmax.
Km indica a adequacidade relativa de substratos a uma
enzima.
Quando mais baixo o valor de Km maior a afinidade do
substrato com a enzima.
Vmax
½ Vmax
Substrato 1
Substrato 2
Km1 Km2
[S]
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Método gráfico para determinação das constantes cinéticas
Em virtude da curva v versus [S] ser uma hipérbole é muito difícil determinar Vmax com
precisão e, portanto, a [S] que fornece ½ Vmax ou o Km.
Para facilitar a determinação das constantes cinéticas, os dados são lançados em gráfico
utilizando um dos métodos gráficos disponíveis.
Gráfico dos recíprocos de Lineweaver-Burk:
1

 versus 1 
[S ] 
v
Rearranjo da equação de Michaelis-Menten numa forma linear v =
Invertendo:
V max ⋅ [ S ]
Km + [ S ]
v
Km + [ S ]
=
Vmax
[S ]
Multiplicando os dois termos:
Separando os termos:
1
v
=
v
Km + [ S ]
Vmax ⋅ [ S ]
1 Km
[S ]
=
+
v Vmax Vmax ⋅ [ S ]
V max
=
[S ]
Km + [ S ]
y = ax + b
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Michaelis-Menten
v
v =
Vmax
V max ⋅ [ S ]
Km + [ S ]
½ Vmax
Km
[S]
Lineweaver-Burk
1/v
1  Km 1 
1
=
×
+

v  Vmax [ S ]  Vmax
tg = Km/Vmax
Onde:
1/V max
-1/Km
1/[S]
a = inclinação da reta
b = interseção da reta em y
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Questão de cinética enzimática
Os seguintes dados foram obtidos para a reação enzimática de transformação de um
substrato (S) em produto (P):
[S] (M)
6,25 x 10-6
7,50 x 10-5
1,00 x 10-4
1,00 x 10-3
1,00 x 10-2
V (nmoles x litro-1x min-1)
15,00
56,25
60,00
74,90
75,00
a) Calcule Vmax e Km.
b) Qual seria v com [S] = 2,5 x 10-5M e com [S] = 5,0 x 10-5M?
c) Qual seria a v com [S] = 5,0 x 10-5M, se a concentração de enzima fosse o dobro?
d) A v dada na tabela a lado foi determinada pela medida da concentração de produto que
se acumulou por um período de 10 minutos. Veja se v representa uma velocidade inicial
verdadeira.
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Resposta da questão
a) v se torna insensível a mudanças da [S] acima de 10-3M. Portanto, na faixa de [S] de 10-3 a
10-2, v deve ser próximo a Vmax
V
max
= 75 nmoles × litro −1 × min −1
Para calcular Km ⇒ escolha qualquer valor de v e a correspondente [S]
[S ]
Vmax Km + [S ]
v
=
∴
75 × 10 −4 = 60 Km + 60 × 10 −4
60
75
=
10−4
Km + 10−4
Km =
15 × 10 −4
60
b) [ S] = 2,5 × 10 −5M = Km e v = 0,5 Vmax ∴
[S ] = 5,0 ×10−5 M
= 0,25 × 10 −4
∴
Km = 2,5 × 10 −5 M
v = 37,5 nmoles × litro −1 × min −1
5 ×10−5
v =
= 5
75 (2,5 ×10−5) + (5 ×10−5 ) 7,5
v=
(5) (75)
∴
7,5
v = 50 nmoles × litro−1 × min−1
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v
c)
V
max
=
[S ]
Km + [S ]
e
V
max
= k [E ]
3
t
∴
v=
[S ]
k [E ]
t
Km + [S ] 3
v é diretamente proporcional à concentração de enzima, para todas as concentrações de
substrato. Portanto, dobrando-se [E]t para a [S] = 5 x 10-5M ⇒ v dobra
∴
v = 100 nmoles × litro −1× min −1
d) Vamos utilizar os valores mais baixos de [S].
[S ] = 6,25 × 10 −6 M e v = 15 nmoles × litro −1 × min −1 ∴
150 × 10−9 M (de S utilizado / litro)
6,25 × 10 −6 M ( de S originalmente presente/ litro)
∴
=
Em 10 min ⇒ 150 nmoles × litro −1
0,150 × 10 −6
6,25 × 10−6
= 0,024 ou 2,4%
Foram utilizados 2,4% de Substrato