Aula de enzimologia
Tema
Cinética enzimática
Prof. Adriane M. F. Milagres
Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena
Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
Cinética das reações catalisadas por enzimas
1. Efeito da concentração de substrato
Conteúdo:
•
Cinética de uma reação simples
•
Determinando Vmax e Km
•
Significado de Km
•
Cinética do tipo cooperativo
A atividade de uma enzima e a concentração do
substrato não são, em geral, proporcionais
Qual a porcentagem dos sítios ativos estão ocupados?
Por que estudar a cinética enzimática?
• Determinar as constantes cinéticas do S e dos inibidores
• Ajudar a elucidar os mecanismos de reação
• Determinar a função de uma enzima em uma rota
metabólica
• Conhecer as condições ótimas de catálise
A velocidade da reação é proporcional a S
Hipótese de equilíbrio rápido e estado estacionário
O modelo de Michaelis-Menten é útil para explicar a cinética das
reações catalisadas por enzimas.
O modelo de Michaelis-Menten considera que uma reação enzimática
ocorre em dois passos:
V = k3 [ES]
K1 [E] [S] = K2 [ES]
K2 = [E] [S]
K1
[ES]
1) V = k3 [ES]
2) [Et] = [E] + [ES]
V = k3 [ES]
[Et] [E] + [ES]
[E] [S]
V = K3 ks
Et E + [E] [S]
ks
V= Vm [S]
ks + [S]
K2 = Ks = [E] [S]
K1
[ES]
[ES] = [E] [S]
ks
Hipótese de Briggs - Haldane
ETAPA 1. Ligação de um substrato (S) a
uma enzima (E), formando um complexo
intermediário (ES)
ETAPA 2.Formação do produto
(P) a partir do complexo ES,
com recuperação da forma livre
da enzima (E)
A reação do anterior está representada no equilíbrio:
onde k1, k2, k3e k4 são as constantes de velocidade de
cada etapa.
Nesse caso, a da reação(V), ou seja, a velocidade de
formação do produto será:
Porém, no estado inicial, podemos simplificar a reação:
A velocidade inicial de reação neste caso é dada por:
Na análise cinética da reação catalisada por uma enzima, consideramos
apenas o ESTADO ESTACIONÁRIO, que é aquele em que, apesar de
estarem mudando as concentrações de S (diminuindo) e de P
(aumentando), não há variação da concentração dos intermediários da
reação.
Velocidade de formação de ES =Velocidade de decomposição de ES
ou...k1[E].[S] = (k2+ k3)[ES] (eq. 3)
A equação 3 pode ser re-arranjada em:
Para simplificar a equação 4, foi definida uma constante,
Km, conhecida como Constante de Michaelis:
No numerador, temos duas constantes de velocidade de reações de
DECOMPOSIÇÃO de ES e no denominador, a constante de velocidade
da FORMAÇÃO de ES.
Dessa forma, Km é uma medida da AFINIDADE da enzima pelo
substrato.
Km ALTO = Baixa afinidade e
Km BAIXO = Alta afinidade
Como toda a enzima que estiver na solução de reação (ETOTAL) corresponde à
soma das espécies E (enzimas livres) e ES (enzimas no complexo com
substrato),
Podemos substituir esta equação na da velocidade inicial da reação é
Vo = k3.[ES]:
Quando todas as enzimas estão na forma de complexo ES, atingimos a
velocidade máxima de reação, ou seja, se [E]TOTAL= [ES], então a equação
10, pode ser representada por:
•Se [S]<<<Km, então: Vo = Vmax [S]
Km
•E se [S] >>>> Km, Vo = Vmax
Vo = K[S]
V0= k3[E]TOTAL
•Se V0=Vmáx/2, temos: Km = [S].
Ou seja, Km corresponde à concentração de S necessária para se atingir a
metade da velocidade máxima!
Significado de Km
• Importante parâmetro da reação enzimática e da função biológica
• Fornece uma medida da [S] para que ocorra uma catálise significativa
• Km esta relacionado as constantes de velocidade de cada etapa da reacão
Significado do kcat/KM: A Eficiência Catalitica
• É uma medida de eficiência da Enzima
• Permite comparar a preferência de uma Enzima para diferentes Substratos
Significado do kcat/KM: A perfeição cinética
Determinação experimental dos parâmetros cinéticos
Diagrama Lineweaver-Burk
(Duplo-Recíproco)
As concentrações de substrato escolhidas devem ser proximas do Km
Críticas ao gráfico L.B.
1)
2)
3)
Aumentos iguais de S que fornecem pontos igualmente espaçados no
grafico V x S não fornecem pontos igualmente espaçados no L.B.
Valores tendem a se agrupar próximo ao eixo 1/v e aparecem poucos
pontos mais altos da escala e são os que devem pesar no traçado da
reta
Pequenos erros na determinação de V se tornam maiores quando se
calcula o seu recíproco.
 Gráfico de Eadie-Hofstee
Não envolve o recíproco de V e podem tornar mais precisos
v
vV
K
max
m [S]
Vmax
v
Inclinação =
-Km
Vmax
Km
v
[S]
 Gráfico de Hanes-Woolf
Mais indicado para dados obtidos com aumentos iguais de S
K
[S]
1
m 

[S]
v
V
V
max
max
[S]
v
Inclinação =
1
Vmax
Km
Vmax
-Km
[S]
Exercício:
1)
Os seguintes dados foram obtidos para uma enzima que catalisa a
reação S-P. As concentrações de substrato abrangem uma faixa
bastante ampla para nos permitir utilizar qualquer um dos gráficos
lineares. Trace os gráficos e determine Km e Vmax.
[S] (M)
V (nmoles/L/min)
8,33 10-6
13,8
1 10-5
16
1,25 10-5
19
1,67 10-5
23,6
2 10-5
26,7
2,5 10-5
30,8
3,33 10-5
36,3
4 10-5
40
5 10-5
44,4
6 10-5
48
8 10-5
53,4
1 10-4
57,1
2 10-4
66,7
INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO
Este gráfico mostra como varia a velocidade inicial de uma reação com o
aumento da concentração de substrato:
Ou seja,Vmáx e Km podem ser
calculados quando V0 é medida
em função de várias concentrações
de substrato.
1) Quando [S] é muito grande –
V = Vmax
P = Vmax . t
Ordem da reação
2) Quando S é muito pequeno
Vo = Vmax [S]
Km
Vo = K[S]
K é uma constante de primeira ordem (min -1)
-dS = kS
dt
d S  1
k

S  dt

S 0
2,3  log
S 
 k t  t 0 
Exercício:
1)
Uma enzima teve sua atividade determinada a uma concentração inicial
de [S] de 2 x 10-5 M. Em 6 min, metade do substrato foi utilizado. O Km
para o substrato é de 5 x 10 -3 M . Calcule a) k, b) Vmax, c) concentração
de produto formado em 15 min.
Enzimas Alostéricas
• Não obedecem a Cinética de Michaelis-Menten
• Quanto maior a [S] maior será a atividade da E até esta alcançar o
Vmax
• A curva da V versus [S] e sigmóide
• Segue modelo da curva de saturação da Hemoglobina com O2
• Sistema cooperativo
Enzimas alostéricas
possuem uma região diferente do sítio ativo e se liga um efetor ou modulador
alostérico. A mudança conformacional decorrente da ligação do efetor alostérico
se propaga pela molécula e afeta o sítio ativo, ativando-o ou inibindo-o.
Ativador alostérico
Inibidor alostérico
Gráfico V x S é uma
curva sigmóide
Enzimas com sítios múltiplos
1) Sitios independentes (hiperbólica)
2) Sítios interdependentes (Sigmoidal)
Enzimas tipo V: efetores alostéricos alteram a Vmax - hiperbólica
Enzimas tipo K: efetores alostéricos alteram o Km - Cinética sigmoidal
(indica cooperatividade)
k’
k3
E + hS ------ ESh ------- ESh-1 + P
V = k3 [ESh] (1)
Et = [E] + [ESh]
[ESh] = [E] [S]h / k’
V = k3 [ESh]
Et [E] + [ESh]
V = k3 [E] [S]h / k’
Et [E] + [E] [S]h / k’
V = k3 [S]h
[Et] k’ + [S]h
V = Vm [S]h
K’ + [S]h
Equações de
V x [S]
[S] é a concentração de substrato
S50 é a concentração de substrato para a qual a enzima está hemisaturada e
em que a velocidade é metade de Vmax.
h é o coeficiente de Hill e é uma medida do grau de cooperatividade (ou
sigmoidicidade): quando h=1 a equação acima simplifica e é igual à equação
de Michaelis-Menten (ausência de cooperatividade).
A equação de Hill também é linearizável:
V=
Vm [S]h
K’ + [S]h
Rearranjando:
vK’ + v[S]h = Vm [S]h
Vk’ = Vm[S]h –v[S]h
Vk’ = (Vm – v) [S]h
V
= [S]h
Vm – V
k’
Log ( V
) = h log [S] - log k’
( Vm – V )
(Equação de Hill)
Exercício:
Determine se a enzima obedece uma cinetica hiperbólica ou
sigmoidal e calcule ou estime as constantes cinética apropriadas
(Km, Vmax ou K’ [S]0,5 , nap e Vmax)
[S] (M x 104)
6,5
12,5
25
50
100
200
400
800
V (micromoles/L/min)
1,54
5,88
20
50
80
94,12
98,46
99,61
Considerações finais:
1) O estudo cinético de uma enzima nos informa sobre o
modo como a atividade da enzima se modifica quando se
alteram as condições do meio em que esta é ensaiada.
2) O estudo cinético de uma enzima é importante para
caracterizar essa enzima, desta maneira distinguindo-a
funcionalmente das demais enzimas inclusive das que
podem catalisar a mesma reação.
3) O desenho de condições de ensaio adequadas à
dosagem de uma enzima numa preparação biológica
complexa é feita com base em estudos de cinética.