Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP
FR 803 – Controle de Qualidade Biológico de Medicamentos e de Cosméticos
Prof. Dr. Rodrigo Ramos Catharino
PIROGÊNIOS
Juliana Filippi Steck
Leila Regina Giarola
Luiza Koreeda
Patricia R Murari
RA048795
RA 062192
RA 062596
RA 063514
Roteiro
• Introdução – Histórico
• Conceito de Pirogênio
• Despirogenização e Métodos
• Teste de Pirogênio por Método In Vivo
• Determinação de Endotoxinas por Métodos In Vitro
• Conclusões
Introdução – Histórico

Gregos
Acreditavam que a FEBRE era um mecanismo mais terapêutico que
fisiopatológico

Início do Séc. XIX
- Billbroth - primeiro a usar o termo “pirogênio” para descrever o
princípio promotor da febre
- Burdon-Sanderson – FEBRE com origem em um agente exógeno,
como a bactéria, ou de origem endógena, da célula do hospedeiro

Final do Séc. XIX
- Centanni - primeiro a reconhecer a relação causa-efeito entre
endotoxina e a febre
- Gram desenvolveu o processo de coloração de bactérias. A partir
daí, concluíu-se que as endotoxinas estavam associadas às Gram (-).
Introdução – Histórico

Passagem do Séc. XIX para o XX
- Existência de injeções e administração
acompanhavam febre e outros efeitos colaterais
parenteral
que
- Os métodos da época de eliminação de bactérias por esterilização
térmica ou filtração não eliminava a pirogenicidade
- Necessidade de planejamento e padronização de testes de
pirogenicidade
- Teste em coelhos - classificava a bactéria em pirogênica e não
pirogênica e as correlacionava com o esquema Gram de classificação
bacteriana.
Introdução – Histórico

1942 - Estudo colaborativo entre a US National Institute of Health e
14 indústrias farmacêuticas - primeiros testes oficiais em coelhos e
incorporação na USP XII.

1952 - Westphal e colaboradores - métodos de extração de
lipopolissacarídeos (LPS) purificados, livres de proteínas, de
diferentes enterobactérias.
Demonstrou-se ser o LPS o responsável pelas reações biológicas
induzidas pela endotoxina, pois causava febre mesmo em
quantidades reduzidas
Conceitos - Pirogênio

Pirogênios Exógenos
Induzem elevações térmicas quando injetados em animais e no homem
Fontes: desde bacteriana, fúngica e viral, bem como componentes de
bactérias Gram (-) e Gram (+), assim como alguns fármacos, esteróides,
frações do plasma etc.

Exemplos:
Streptococos grupo A - produz toxinas que causam avermelhidão na pele,
comprovadamente potente fonte de pirogênios.
Vírus - são provavelmente responsáveis por mais episódios pirogênicos em
humanos que qualquer outro agente isolado.
Fungos - têm se mostrado altamente pirogênicos quando injetados via
intravenosa em animais experimentais, permanecendo não claro o
mecanismo indutor.
Conceitos - Pirogênio

Pirogênios endógenos
São produzidos internamente pelo hospedeiro, sintetizados por
diferentes células em resposta ao estímulo e exposição aos
pirogênios exógenos.
Aparentemente, o pirogênio endógeno e exógeno são considerados
mediadores primários da febre, pois induzem uma elevação da
temperatura corporal a partir de substância obtida de leucócitos
polimorfonucleares e da produção de prostaglandinas.
Endotoxina – Composição Química

As endotoxinas são complexos de alto
peso molecular associados à
membrana externa de bactérias Gram
(-), e se constituem na mais
significante fonte de pirogênio para a
indústria farmacêutica.

Endotoxinas não purificadas podem
conter lípides, carboidratos e proteínas.

Quando purificadas são denominadas
de lipopolissacarídeos (LPS) para
enfatizar sua natureza química.
LPS – Composição Química

Lipídeo A - composto de um
dissacarídeo de glucosamina,
altamente substituído por ácidos
graxos de cadeia longa com
grupamentos amida e éster.

Possui atividade biológica de
pirogenicidade, toxicidade letal,
necrose da medula óssea, ativação do
complemento, queda de pressão
sanguínea, agregação plaquetária,
indução de tolerância à endotoxina,
atividade de macrófagos etc.
Endotoxina – Indução da Febre

Fagocitose do lipídeo A

Produção de pirogênio endógeno que
atravessa a barreira
hematoencefálica

Alteração do ponto de equilíbrio dos
neurônios reguladores de
temperatura do hipotálamo anterior

Recentemente descobriu-se um
aumento na concentração de
prostaglandina E2 e adenosina
monofosfato cíclica (cAMP) no fluido
cerebroespinal de coelhos
Níveis Pirogênicos

A questão torna-se crucial ao considerar
os limites de liberação para os produtos
farmacêuticos

Teste in vivo - Importância de determinar a
sensibilidade relativa de coelhos e
humanos a várias endotoxinas, visando a
segurança no uso de medicamento
parenteral em humanos.

Deve-se levar em consideração que a
pirogenicidade pode depender de qual a
endotoxina estudada, assim como do nível
da dose.
Níveis Pirogênicos

Os limites atualmente considerados aceitáveis (FDA) para endotoxina
bacteriana são:

produtos farmacêuticos e biológicos: 5 UE/kg;

radiomarcadores: 2,5 UE/kg;

parenterais de grande volume: 0,5 UE/mL;

água para injeção: 0,25 UE/mL;

drogas intratecais: 0,2 UE/mL;

correlatos: até 0,5 UE/mL;

correlatos intratecais: 0,06 UE/mL.
PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO
DESPIROGENIZAÇÃO
INATIVAÇÃO
• TRATAMENTOS QUÍMICOS
REMOÇÃO
• DIFERENTES MÉTODOS,
(QUEBRA OU BLOQUEIO
DE SÍTIOS NECESSÁRIOS À
ATIVIDADE PIROGÊNICA)
CONSIDERANDO
CARACTERÍSTICAS FÍSICAS
DAS ENDOTOXINAS:
• ALTAS TEMPERATURAS
• TAMANHO
(DESTRUIÇÃO TOTAL DA
MOLÉCULA)
•PESO MOLECULAR
•CARGA ELETROSTÁTICA
•AFINIDADE A SUPERFÍCIES
DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO
• HIDRÓLISE ÁCIDA
•Despirogenização através da desativação
do lipídeo A (2 possíveis mecanismos).
•Empregado
na
despirogenização
de
Rompimento de
ligação lábil junto ao
lipídeo A, desativando
o LPS.
materiais.
•Utiliza-se HCl 0,05 N por 30 minutos a
100oC ou ácido acético glacial 1,0% por 2 a
3 horas a 100oC.
MEMBRANA EXTERNA
Alteração da
conformação do lipídeo
A (sítios funcionais ou
cliva ácidos graxos)
PAREDE CELULAR DAS BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS
DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO
• OXIDAÇÃO
• Despirogenização através da aplicação
Mecanismo sugerido: oxidação
dos ácidos graxos presentes
no lipídeo A
de peróxido de hidrogênio.
• Empregado na obtenção da Água Estéril
para Injeção USP, solução salina normal e
salina-dextrose, lavagem de componentes
plásticos empregados na fabricação de
correlatos.
• Efetividade é dependente do tempo, pH e
concentração do agente químico.
• Vantagem: segurança
no manuseio,
facilidade de eliminação da solução, e a
inativação de endotoxinas.
• Desvantagem:
pode ser capaz de
degradar alguns componentes de produtos.
MEMBRANA EXTERNA
O peróxido de hidrogênio pode ser
substituído por oxigênio molecular, ácido
hipocloroso,
periodato
de
sódio,
permanganato de potássio diluído,
permanganato neutro, ácido nítrico,
dióxido de selênio, porém, com maiores
limitações de compatibilidade.
DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO
• ALQUILAÇÃO
• Despirogenização através da aplicação de óxido de etileno.
• Podem também ser aplicados os anidridos acético e succínico, que
atuam através de acetilação e succinilação.
• A alquilação ocorre através de substituição nucleofílica na ligação
glucosamina do lipídeo A.
• Método é compatível com materiais termolábeis, empregados na
fabricação de produtos médico-hospitalares.
DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO
• PROCESSO TÉRMICO
• Despirogenização através da aplicação de calor seco
• Método de escolha para materiais termoresistentes, como frascos de
vidros e instrumentos metálicos
• O método padrão é de exposição a 250oC ou mais, por 30 minutos ou
mais
• Mecanismo de inativação é a incineração
DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO
• LAVAGEM
• Destaca-se como um dos métodos mais antigos e simples
• Utilizado para remoção de endotoxinas de superícies sólidas.
• Emprega-se para lavagem um solvente apirogênico, usualmente Água
Estéril para Injeção USP.
• Efetivo para a remoção de baixos níveis de endotoxinas superficiais,
presentes em vidrarias, tampas e dispositivos.
DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO
• DESTILAÇÃO
• Destaca-se como um método efetivo para remoção de pirogênios da
água
• Nesse processo, a água é submetida a duas alterações de fase, de
líquida a vapor e de vapor a líquida
• A rápida fervura leva a água ao estado de vapor, enquanto moléculas de
LPS, de elevado peso molecular, permanecem na fase líquida
• A água recém destilada é coletada e mantida em frascos
despirogenizados estéreis
DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO
• ULTRAFILTRAÇÃO
• Método com mecanismo fundamentado em limites de exclusão de peso
molecular
• Efetividade é dependente das membranas, empregadas como filtros
despirogenizantes: endotoxinas que excedem determinado valor limite de peso
molecular permanecem retidas
• Subunidades do LPS (monoméricas) possuem cerca de 10.000 a 20.000
daltons de tamanho: podem ser removidas por um ultrafiltro molecular de
10.000
• Subunidades agregadas possuem cerca de 300.000 a 1 milhão de daltons:
removidas efetivamente por ultra-filtros que retém moléculas de 100.000 daltons
ou maiores
• É empregado em uma ampla faixa de fármacos, soluções de baixo a médio
peso molecular, antibióticos e na produção de solução eletrólito.
DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO
• OSMOSE REVERSA
• Utiliza-se uma membrana constituída de materiais de acetato de celulose ou
poliamida, com poros pequenos o suficiente para a exclusão de íons
(porosidade nominal de cerca de 10 Ao)
• Essa membrana remove endotoxinas por simples exclusão de tamanho,
retendo os pirogênios
• Efetivo para remoção de endotoxinas de água, exclusivamente, já que pode
ocorrer a passagem de outras moléculas, distintas da água
Consiste, juntamente com o método de
destilação, em um processo reconhecido na USP
para a produção de Água Estéril para Injeção.
DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO
• CARVÃO ATIVO
• Despirogenização de soluções através de adsorção de endotoxinas ao carvão
ativo
• É feita a adição do carvão à solução, esta é agitada, e finalmente o carvão é
removido por filtração ou precipitação
• Eficaz para soluções com eletrólitos, porém, o carvão possui afinidade por
substâncias não ionizadas de elevado peso molecular, limitando sua aplicação
em algumas situações
• Evita-se seu uso em soluções contendo baixas concentrações de agentes
ativos, já que podem ser adsorvidos
• Outra possível limitação deste método pode ser a remoção de traços de
carvão, que pode ser contornada com o emprego de carvão sintetizado.
Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In Vivo
• Foi o primeiro teste para comprovação de apirogenicidade em produtos injetáveis a
fazer parte da Farmacopéia Americana (1942).
• Este teste tem em seu favor o envolvimento de toda a reação fisiológica do animal.
• É um ensaio limite, com a chance de aprovar ou rejeitar uma amostra mediante
resposta obtida a partir de um grupo de coelhos, que devem atender a um nível
padrão de estado febril.
Teste de Hipertermia em Coelhos
• Um grupo de coelhos recebe injeção intravenosa da amostra e é observado,
geralmente por 3 horas, tendo sua temperatura corpórea monitorada, antes e
durante o teste.
Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In Vivo
Modelo Animal
• Coelho Adulto: escolhido porque quanto à sensibilidade do teste é equivalente
quando comparados aos humanos. Ou seja, o sistema regulador de temperatura do
coelho tem características parecidas com as humanas.
• Peso: mínimo de 1,5kg (praticidade analítica). Melhores raças são: Holandesa,
Himalaia e Polaca.
• Coelhos Specific Pathogen Free: é recomendado por possuir melhor padrão
microbiológico. Evita tolerância passageira e imunização natural cruzada.
• Triagem do animal: importante que os animais sejam testados no momento da
escolha do grupo para saber se está respondendo ao estado febril.
Nucleianato Sódico (5mg/kg) – 0,8 a 1,2°C
Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In Vivo
Modelo Animal
• Condicionamento: animais devem ser treinados (estímulos adversos podem
interferir gerando falsos-negativos e falsos-positivos).
• O animais podem ser reutilizados, porém deve-se respeitar períodos de descanso:
2 a 3 dias (animais que receberam material apirogênico) ou 2 a 3 semanas (animais
que receberam material positivo para pirogenicidade).
• Condições do Biotério: respeitar a neutralidade térmica de cada espécie, boas
instalações, renovação do ar constante, barreiras acústicas e controle de insetos e
outros roedores.
Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In Vivo
Material Auxiliar
• Vidraria: usada para o preparo de amostras devem ser despirogenizadas
previamente por tratamento térmico.
• Tomada de Temperatura: Utiliza-se par termoelétrico (preferencialmente) inserido
no reto do animal. Termômetros clínicos depois de calibração podem ser utilizados.
• Antes do início do teste os animais escolhidos devem passar controle de
temperatura, a fim de determinar a flutuação térmica (~0,3°C). – Valor médio serve
como controle.
Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In Vivo
Amostra
• Sob o ponto de vista do controle de qualidade todos os injetáveis de grande e de
pequeno volume devem ser testados.
• Produtos de grande volume e de pequeno volume com administração intravenosa
requerem atenção, bem como aqueles de inoculação intratecal – (1000 vezes mais
potente).
• Sensibilidade: é uma limitação do teste in vivo. Concentrações menores que 50
pg/mL, na dose de 10 mL/kg não são detectáveis.
• Padronização da dose: geralmente 10 mL/kg para injetáveis de grande volume e
líquidos extraídos de materiais plásticos.
Dose pirogênica = homem = coelho – então coelho recebe dose maior que a
terapêutica para maior segurança do teste. Recomenda-se no mínimo 1 décimo / kg
da dose.
Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In Vivo
Amostra
• Fármacos que atuem sobre o sistema termo-regulador não permitem detectar a
presença de contaminantes termogênicos. Para esses usa-se métodos alternativos,
ou a amostra deve ser tratada para impedir a interferência do princípio ativo.
• Produtos incompatíveis com teste: hipnóticos, anestésicos, gluconato de cálcio,
alguns antibióticos como anfotericina e vincomicina, radiofármacos.
Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In Vivo
Interpretação de Resultados
• Classificação final: apirogênico, pirogênico, duvidoso.
• Amostra deve ser testada em 3 animais e os dados são confrontados com uma
tabela de elevação térmica cumulativa padrão.
< 1,15°C
Amostra apirogênica
> 2,65°C
Amostra pirogênica
1,15°C < Amostra < 2,65°C
Reteste
• Amostra duvidosa é retestada em outros 3 animais e comparada a nova tabela.
Pode ser retestada por no máximo 12 animais.
6 animais testados
2,8 a 4,3°C
9 animais testados
4,45 a 5,95°C
12 animais testados
6,6°C
Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In Vivo
Interpretação de Resultados
• Farmacopéia Brasileira IV – 1996
Determina um valor de elevação térmica crítica: >0,6°C
Limite para somatória de 3 coelhos: 1,4°C
Caso uma exigência não seja atendida a amostra é retestada em outro 5
coelhos. Destes novos animais, não mais q 3 devem podem acusar elevação térmica
crítica. E o valor da somatória dos 8 coelhos não deve exceder 3,7°C.
• Produtos imunoterápicos: permitem elevação térmica maior por produzirem
aumento da temperatura corpórea naturalmente.
Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In Vivo
Métodos não Oficiais
• Toxicidade de pirogênio bacteriano em embrião de galinha
• Associação de endotoxinas em Actinomiciana D em camundongos
• Hipoferremia em ratos
• Determinação de leucopenia e leucocitose em camundongos
Estes testes visam a determinação da DL50 ou a quantificação de parâmetros
hematológicos relacionados à dose de pirogênio bacteriano. Entretanto nenhum é
aplicado para o controle de medicamentos quanto à inocuidade por substâncias
termogênicas.
Método in vitro
Lisado de Amebócito de Limulus (LAL);
Limulus polyphemus;
Amebócitos + Ca²+ + endotoxina = coagulação =
gel
Método in vitro
Esquema de preparo do LAL
• sangria de caranguejos Limulus
polyphemus.
• anticoagulante,
como
Netilmaleimida 0,125% em solução a
3% de cloreto de sódio.
• centrifugada por 10 minutos e o
sobrenadante é desprezado.
• lavagem em cloreto de sódio a 3%.
• choque osmótico pela adição de
água destilada apirogênica ou outro
mecanismo.
• estável a 4°C por ao menos 3
anos.
Método in vitro
Métodos analíticos:
•
•
•
•
•
Ponto Final de Gelificação;
Ensaio Turbidimétrico;
Método Colorimétrico de Proteína de Lowry;
Método Nefelométrico;
Método Cromogênico;
Método in vitro
Ponto final de gelificação
Método in vitro
Ensaio turbidimétrico
• qualquer aumento na concentração da endotoxina causa
um proporcional aumento na turbidez devido à
precipitação de proteína coagulável no lisado.
• quantificação de endotoxina pelo método turbidimétrico
exige que o lisado seja diluído a níveis que impeçam a
formação do coágulo.
Método in vitro
Método Cromogênico
Essa liberação é proporcional a concentrações crescentes de endotoxina.
Método in vitro
Vantagens
• simples e fácil de ser aplicado
• 155 avaliações conduzidas, 24 foram positivas apenas no
LAL e não no ensaio de coelhos USP.
• Embora duas amostras apresentassem resultados positivos
no ensaio animal e negativo no LAL, os dados sugeriam
sensibilidade superior no LAL.
Método in vitro
Desvantagens
• vulnerabilidade a estações e lotes.
• o teste de LAL não determina a presença de outras
substâncias que promovam reação febril além da
endotoxina.
• podem haver outros componentes
aumentem a velocidade dessa reação.
• teste de compatibilidade do produto.
que
inibam
ou
Método in vitro
Abrangência do método
• Farmacopéia Brasileira: admite o método de gelificação,
turbidimétrico ou colorimétrico do tipo cinético ou leitura final,
embora detalhe particularidades apenas para o primeiro.
• Para ser empregado o método de LAL, o fabricante de produto
farmacêutico, biológico ou correlato deve obter dados quanto à
sensibilidade, inibição/exacerbação e, se adequado, teste de
sensibilidade de colônia de coelhos a ser empregada.
CONCLUSÕES
Todo o processo produtivo deve ser realizado em condições de higiene,
envolvendo desde os operadores até o ambiente, empregando-se processos
validados, pessoal qualificado e treinado, tendo-se sempre em foco as boas
praticas de fabricação, de forma que o produto obtido seja apirogênico,
dispensando tratamentos adicionais.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Pinto, T. J. A., Kaneko, T. M. , Ohara, M. T. “Controle Biológico de
Qualidade de Produtos Farmacêuticos, Correlatos e Cosméticos”, 2ª
Edição, Atheneu, 2003. p 181-215.
Fukumori, N.T.O. Determinação de Endotoxina Bacteriana (Pirogênio) em
Radiofármacos pelo Método de Formação de Gel. Validação. Dissertação
de Mestrado em Ciências na área de Tecnologia Nuclear. São Paulo. 2008.
Silveira, L.R., Andrada, S.S., Schimidt, C.A., Casali, R.G., Dalmora, S.L.
Comparative Evaluation Pyrogenens Tests in Pharmaceutical Products.
Brazilian Journal of Microbiology. v.35, p.48-53, 2004.
Barth, T., Dalmora, V.J., D´Avila, F.B., Dalmora, S.L. Avaliação de
Pirogênios em Produtos de Uso Veterinário pelos testes de Hipertermia em
Coelhos e do Lisado de Amebócito do Limulus. Ciência Rural, v.37, n.1,
p.190-4., Jan-Fev 2007.
OBRIGADA PELA ATENÇÃO!