Método Analítico para controle de qualidade microbiológico
de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana
- Definições: pirogênio endógeno e exógeno , endotoxina bacteriana
(lipopolissacáride)
- Aplicação e abrangência
- Ações biológicas da endotoxina bacteriana
- Métodos de despirogenização e sua aplicação em produtos estéreis
- Produtos Apirogênicos
- Teste de pirogênio: método de detecção in vivo
- Teste de endotoxina : método de detecção in vitro – Kit LAL
- Vantagem e desvantagens dos métodos in vivo e in vitro
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de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana
Pirogênio: Substância que induz a febre, proveniente de um
produto injetável.
São divididos em 2 classes:
a) Pirogênios exógenos
b) Pirogênios endógenos
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de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana
Pirogênios exógenos: São substâncias originárias fora do corpo
e induzem a elevações térmicas quando injetados em humanos e
animais.
Ex.: Endotoxina bacteriana (lipopolissacarídeo)
Mais importante pirogênio exógeno.
Outros Pirogênios exógenos: bactéria, fungo, vírus e outros não
microbianos, como por exemplo fármacos, esteróides, frações do
plasma, e adjuvante sintético muramil dipeptídeo.
Produtos estéreis = ausência de microrganismos viáveis e
apirogênicos
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de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana
Endotoxinas bacterianas:
- São complexos de alto peso molecular associados a membrana
externa de bactérias Gram negativas, sejam elas patogênicas ou
não.
- São altamente resistentes ao calor, dessecação, tratamentos
químicos e pH extremos.
- São liberadas durante o processo de multiplicação bacteriana
ou quando morrem.
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de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana
Cont. Endotoxinas bacterianas:
- Constituem maior fonte de pirôgenio para a Indústria
Farmacêutica
* Diferença entre endotoxina e lipolissacarídeo (LPS)
A atividade biológica da endotoxina está associada ao LPS da
membrana externa de bactéria Gram negativa
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de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana
Pirogênios endógenos: É produzido internamente pelo
hospedeiro em resposta ao estímulo de pirogênio exógeno.
Produtos estéreis: ausência de m.o viáveis e
apirogênicos
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de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana
Aplicação:
- Produtos farmacêuticos injetáveis , como fármacos, soluções
de injetáveis de pequeno e grande volume.
- Produtos correlatos ligados a injetáveis ( seringas, agulhas,
catéteres)
- Embalagens de acondicionamento de produtos injetáveis
- Próteses
- Fluidos para infusão
Ações Biológicas da Endotoxina Bacteriana
- São tóxicas para a maioria dos mamíferos
- Quando injetadas - injeção de células vivas, mortas ou purificadas
(LPS), podem causar várias reações fisiológicas, tais como:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
Febre
Alteração na contagem de leucócitos
Coagulação intravascular
Hipotensão
Apatia
Dores de cabeça
Convulsão
Até mesmo a morte
Devido a estes fatores, é de grande importância a detecção e
eliminação das endotoxinas bacterianas de produtos
farmacêuticos injetáveis
Processos de Despirogenização
Existem 2 grandes
Despirogenização:
a) Processo de Inativação
b)
Processo de Remoção
classes
de
Processos
de
Processos de Despirogenização
Processo de Inativação da Endotoxina
1) Hidrólise ácido – básica ou alcalina
- Reduz ou elimina a atividade do LPS, pela desativação do
lipídeo A ( considerado responsável pela ação biológica)
HCl 0,05N por 30 min a 100ºC ou
Ácido acético glacial 1% por 2 – 3 h a 100ºC
Aplicação: Despirogenização de materiais
Processos de Despirogenização
Processo de Inativação da Endotoxina
2) Oxidação
- Inativação oxidativa da endotoxina bacteriana com peróxido de
Hidrogênio (H2O2). É dependente do tempo, pH e concentração.
Aplicação: Eliminação de pirogênio da água estéril para injeção
USP, solução salina normal,
salina dextrose, lavagem de
componentes plásticos na fabricação de correlatos.
Vantagem : ausência de peróxido no final do processo
Outros produtos, porém com limitações: ácido hipocloroso ou
hipoclorito, ácido nítrico, dióxido de selênio,entre outros.
Processos de Despirogenização
Processo de Inativação da Endotoxina
3) Alquilação
Um agente alquilante é o gás óxido de etileno, que, segundo
alguns estudos, pode promover a redução da atividade de
endotoxinas bacterianas, além de promover a esterilização de
produtos.
Aplicação: produtos médicos - hospitalares
Outros agentes alquilantes: tratamento com anidridos acéticos e
succínico
Processos de Despirogenização
Processo de Inativação da Endotoxina
4) Processo térmico – Calor seco
-
Estufas
Túneis por convecção, condução ou irradiação (Infravermelho)
Aplicação: Método de escolha para materiais temoresistentes,
como frascos de vidro e instrumentos metálicos
Processo de despirogenização: Exposição do material a 250ºC ,
no mínimo por 30 min. Ocorre incineração.
Autoclavação não é efetiva para inativação de endotoxinas
Processos de Despirogenização
Processo de Inativação da Endotoxina
5) Radiação Ionizante Cobalto ( Co60)
- Reduz a toxicidade de endotoxinas, porém, são dose
dependentes.
- Pode aumentar alterações químicas desconhecidas em
fármacos e soluções parenterais.
- Seu uso na despirogenização de materiais não tem sido
considerado.
Seus riscos podem superar suas propriedades benéficas
Processos de Despirogenização
Processo de Inativação da Endotoxina
6) Polimixina B
- Antibiótico pode anular a atividade do LPS.
- Mais estudos devem ser feitos, pois a Polimixina pode interferir
no teste LAL ( para determinação de endotoxina bacteriana in
vitro)
Processos de Despirogenização
Processo por Remoção de Endotoxina
1) Lavagem
- Método mais simples e um dos mais antigos para remoção de
endotoxinas.
- Efetivo
- Lavagem com solvente apirogênico : Água estéril para injetáveis
USP.
Aplicação: Vidrarias, dispositivos médicos, tampas e superfícies
de materiais.
Processos de Despirogenização
Processo por Remoção de Endotoxina
2) Destilação
- Método mais antido para remoção de endotoxinas.
Mecanismo: Alteração de fase:
a) L para V – Água ( vapor) e LPS ( Líquido)
LPS ( Alto peso molecular) : tende a cair, devido a gravidade.
b) V para L – Água Condensa, sem as endotoxinas.
Aplicação: Remoção de pirogênio da água
Processos de Despirogenização
Processo por Remoção de Endotoxina
3) Ultrafiltração
-Utilização de membranas ultrafiltrantes
Tamanho da subunidade básica do LPS: 10.000 a 20.000 daltons.
Mecanismo: Filtros despirogenantes – exclusão por peso
molecular / tamanho da partícula.
Aplicação: Fármacos (ex. antibióticos) e soluções de baixo a
médio peso molecular.
Processos de Despirogenização
Processo por Remoção de Endotoxina
4) Osmose reversa
- Filtração sobre pressão .
- Membranas constituída de acetato de celulose ou poliamida, com
pequenos poros para exclusão de partículas.
Mecanismo: Exclusão por tamanho - poros pequenos impedem a
passagem de pirogênios.
Aplicação: Produção de água estéril para injeção. Método
reconhecido pela USP, assim como o processo de Destilação.
- Consegue remover de 99,5 a 99,9 % da carga pirogênica do
sistema.
Processos de Despirogenização
Processo por Remoção de Endotoxina
5) Carvão Ativado
- Adição de carvão a solução
- Pode ser aplicado em ampla faixa de pH
Mecanismo: Adsorção de partículas pirogênicas (endotoxina) ,
agitação e remoção do carvão por filtração.
Aplicação: Soluções de eletrólitos.
Limitações:
- Pode ocorrer a adsorção de ingredientes ativos, devido sua
afinidade por subst. não ionizáveis de elevado peso molecular.
Processos de Despirogenização
Processo por Remoção de Endotoxina
6) Atração por membrana hidrófoba
- Polímeros de polipropileno, polietileno, polifluoreto de
vinilideno e politetrafluoretileno apresentam afinidade para ligação
a endotoxina.
Mecanismo: Processo de microfiltração com estes materiais são
empregados permitem efetiva eliminação de endotoxinas por
ADSORÇÃO
Aplicação:Subst. instáveis hormônios, antibióticos e substâncias
difíceis de despirogenizar pelos métodos tradicionais.
Produtos Apirogênicos:
È importante ressaltar que:
1) Apesar dos métodos de despirogenização, existem limitações (
natureza do produto, riscos envolvidos ou aspectos econômicos)
2) Deve – se avaliar a natureza do produto ara escolha do
processo de despirogenização adequado.
3) É importante seguir a BPF, para que se possa obter um produto
apirogênico e não haver necessidade de tratamentos adicionais
Teste de Pirogênio
1) Teste in vivo
2) Teste in vitro
Teste de Pirogênio : Método in vivo
-
Também conhecido como Método biológico ou Método in vivo
-
Teste de hipertermia realizado em coelhos.
- Consiste em injetar uma solução nas veias periféricas das
orelhas de coelhos.
- Após a injeção, verifica-se se ocorre uma reação pirética, ou
seja, um aumento da temperatura do corpo do animal (febre).
- A elevação da temperatura indicará a presença de pirogênios na
solução.
Teste de Pirogênio : Método in vitro
-
Também conhecido como Teste LAL ou Método in vitro
-
Teste LAL (Limulus Amebocyte Lysate): proteína de caranguejo
- Caranguejos de espécie Limulus polyphemus
- Ocorre uma reação entre o componente proteico do LAL e a
endotoxina bacteriana.
- Consiste em adicionar o reagente
LAL , que é uma proteína que coagula
ou gelifica na presença de endotoxinas
bacterianas.
Teste de Pirogênio : Método in vitro
Métodos analíticos
1) Ponto Final de Gelificação
- Mais simples e amplamente utilizado
- Consiste em adicionar solução e reagente em quantidades iguais
em tubo de ensaio despirogenizado.
- Mistura-se LAL com a solução a ser analisada e incuba-se por 1h
a 37ºC.
- Inversão dos tubos a 180º
- Positivo: formação de gel
- Negativo : não formação de gel
Teste de Pirogênio : Método in vitro
Métodos analíticos
2) Ensaio Turbidimétrico
- Permite medida quantitativa da endotoxina em diferentes faixas
de concentração
- O método é baseado no fato em que: Aumento da
concentração de toxina é proporcional ao aumento da turbidez da
solução, devido a ppt de proteína coagulável.
- Mistura se a solução com o reagente e incuba-se para reação
da endotoxina.
- Realiza-se a leitura em espectrofotometria de absorção,
calculando-se a concentração (compara-se com padrão).
Questão Provão / ENADE – 2001
As diálises peritoneais, administradas em pacientes em hospitais,
têm sido causa de infecções. As análises das soluções
determinaram a presença de pirogênio.
a) Quais as consequências para um paciente que recebe
formulações medicamentosas injetáveis contaminadas com
pirogênio?
b) Como é realizada a pesquisa do pirogênio em medicamentos?