Controle de Qualidade Biológico e
Microbiológico de Produtos Farmacêuticos e
Cosméticos
Teste de Endotoxinas bacterianas
Prof. Fernando Henrique Andrade Nogueira
Teste de Endotoxinas bacterianas




É considerado um método alternativo ao dos
coelhos (USP XX – 1980)
Mais rápido e mais sensível → endotoxina
Teste in vitro – ausência da resposta fisiológica do
animal ao pirogênio.
Dúvidas quanto à deteção de pirogênio não
oriundo de bactérias Gram (-)
Teste de Endotoxinas bacterianas




O lisado do amebócito do caranguejo Limulus
polyphemus coagula em contato com endotoxinas
bacterianas
O sangue do caranguejo é drenado e centrifugado
Os amebócitos são separados e lisados com o uso
de solução hipotônica ou métodos mecânicos
O lisado é então estabilizado e liofilizado, sendo
estável por 3 anos a 4 oC
Teste de Endotoxinas bacterianas
Princípio da técnica:

Reação enzimática entre o lisado (LAL) e a
endotoxina resultando em coagulação

Temperatura ótima – 37 a 39 oC

pH ótimo – 6,0 a 7,0
Teste de Endotoxinas bacterianas
Materiais:


Todos os materiais devem ser apirogênicos (30
minutos a 250 oC ou equivalente)
Água reagente para LAL: deve-se utilizar água
estéril para injetáveis ou outra que não reaja com
o LAL no limite de sensibilidade deste
Teste de Endotoxinas bacterianas




Os reagentes são disponibilizados em kits
Reagente LAL: padronizado para detectar 0,03;
0,06; 0,125 e 0,25 unidades de endotoxina (UE)
por ml
A quantidade de LAL utilizada é fixa (0,1 ml)
Pode ser congelado a -4 oC e utilizado em até 4
semanas
Teste de Endotoxinas bacterianas


Endotoxina bacteriana: reconstituir com 5 ml de
água estéril e apirogênica e agitar em vórtex por 5
minutos. Guardar em 2 a 8 oC por até 4 semanas
São preparadas diluições seriadas do padrão de
endotoxina para a determinação da sensibilidade
do lisado (LAL) e para comparação no teste
propriamente dito.
Teste de Endotoxinas bacterianas


Amostra: deve ter o pH ajustado para a faixa de
6,0 a 7,5; a menos que citado diferentemente na
monografia
Podem ser empregadas soluções apirogênicas e
estéreis de NaOH ou HCl 0,1 M ou mais diluídas
Teste de Endotoxinas bacterianas
Método semi-quantitativo
Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste)

Sensibilidade do LAL: menor quantidade
endotoxina detectável pelo reagente

Teste realizado em quadruplicata

Controle negativo: água + LAL
de
Teste de Endotoxinas bacterianas
Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste)



Diluições seriadas do padrão de endotoxina
compreendendo 0,25; 0,5; 1 e 2 vezes a
sensibilidade rotulada (λ) do lisado
Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml
Concentrações de endotoxina: 0,03; 0,06; 0,12 e
0,24 UE/ml
Teste de Endotoxinas bacterianas
Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste)



Incubar por 1 hora a 37 oC
Reação positiva: gel firme mesmo quando invertido
a 180º
Reação negativa: não forma gel firme ou forma gel
viscoso que não mantém a integridade quando
invertido
Teste de Endotoxinas bacterianas
Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste)



Ponto final – maior diluição da endotoxina que
apresenta resultado positivo
Sensibilidade do lisado = antilogaritmo da média
dos 4 pontos finais convertidos em log
Deve estar entre 0,5 e 2 vezes a sensibilidade
rotulada do lisado (λ)
Teste de Endotoxinas bacterianas
Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste)
Réplicas
1
2
3
4
0,50
+
+
+
+
0,25
+
+
+
+
0,12
+
+
+
+

0,06
+

+

0,03 Ponto final Log10 do ponto final
0,06
-1,222

0,12
-0,921

0,06
-1,222

0,12
-0,921

média = -1,0715
Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml
10-1,075 = 0,08 UE/ml; de acordo (0,06 – 0,24)
Teste de Endotoxinas bacterianas
Teste propriamente dito



A quantidade do reagente LAL é a mesma em
todos os tubos (0,1 ml)
A endotoxina é diluída em série geométrica que
deve compreender a faixa de 0,5 a 2 λ
A amostra é diluída em série até que o ponto final
seja alcançado
Teste de Endotoxinas bacterianas
Teste propriamente dito



Soluções preparadas em duplicata (exceto o
controle negativo)
Agitar levemente os tubos e incubar a 37 oC por 1
hora. Os tubos não podem sofrer vibração
Reação positiva, negativa e ponto final da mesma
maneira que no teste de sensibilidade do lisado
Teste de Endotoxinas bacterianas
Teste propriamente dito


Controle negativo: água + LAL
Controle positivo da amostra: endotoxina +
amostra + LAL – verificar a interferência da
amostra com a sensibilidade do lisado – 0,5 a 2 λ

Padrão: diluições endotoxina + LAL - 0,5 a 2 λ

Amostra: diluições produto + LAL → UE/ml
Teste de Endotoxinas bacterianas
Cálculos e interpretação


Sensibilidade do lisado - antilogaritmo da média
dos 2 pontos finais convertidos em log
Concentração
de
endotoxina
na amostra:
sensibilidade rotulada do lisado multiplicado pela
diluição da amostra na última reação positiva

A concentração de endotoxina na amostra deve ser
inferior à especificada na monografia individual
Teste de Endotoxinas bacterianas
Exemplo:
Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml
Controle negativo: água + LAL
Controle positivo da amostra:
1
+
+
+


Ponto
final
0,12
2
+
+
+


0,12
Réplicas 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03

Log10 do ponto
final
-0,921
-0,921
média = -0,921
10-0,921 = 0,12 UE/ml (0,06 – 0,24)
Teste de Endotoxinas bacterianas
Exemplo:
Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml
Controle positivo – padrão
Réplicas 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03
Ponto
final
Log10 do ponto
final
1
+
+
+


0,12
-0,921
2
+
+
+
+

0,06
-1,222

média = -1,072
10-1,072 = 0,08 UE/ml (0,06 – 0,24)
Teste de Endotoxinas bacterianas
Exemplo:
Sensibilidade rotulada do lisado (λ)= 0,12 UE/ml
Amostra: 10-1,054 = 0,088 // 1/0,088 = 11,4
Réplicas 1/2 1/4 1/8
1/16
1/32 1/64
1
+
+
+



2
+
+
+
+



Ponto
final
1/8 =
0,125
1/16 =
0,0625
Log10 do
ponto final
-0,903
-1,204
média =
-1,054
Teste de Endotoxinas bacterianas
Cálculo da concentração de endotoxina



Multiplica-se a concentração de endotoxina pela
sensibilidade do lisado rotulada (λ)
0,12 x 11,4 = 1,37 UE/ml
Esse valor deve ser inferior ao especificado na
monografia individual
Teste de Endotoxinas bacterianas
Máxima diluição válida (MDV)

A amostra não pode ser diluída indefinidamente.
Prejuízo da detecção de endotoxina
Lim ite de endotoxina Concentração do produto
MDV 
Sensibilidade rotuladado lisado


Se o limite é expresso em UE/mg ou UE/UI,
utilizar a fórmula acima
Se o limite é expresso em UE/ml, basta dividi-lo
por λ
Teste de Endotoxinas bacterianas
Máxima diluição válida (MDV)


O resultado da diluição da amostra não deve ser
maior que a MDV → mais diluído que a MDV
Pode se utilizar reagente LAL de sensibilidade
maior, permitindo soluções amostra mais diluídas
MDV 
Lim ite de endotoxina Concentração do produto
Sensibilidade rotuladado lisado
Teste de Endotoxinas bacterianas
Fatores críticos para o teste utilizando LAL:


Tempo: 60 ± 2 minutos. Temperatura: 37 ± 1 oC
(banho-maria ou estufa)
Não expor os tubos a vibrações – resultados falsonegativos

pH: 6,0 a 7,5. Perda de sensibilidade do lisado

Perda de água por evaporação - concentração
Teste de Endotoxinas bacterianas
Fatores críticos para o teste utilizando LAL:

Concentração adequada de cátions divalentes – já
adicionados no reagente LAL