Genoma funcional: identificar genes diferencialmente expressos
Alguns fatos que afetam a eficiência dos métodos em identificar esses genes
15 mil a 30 mil diferentes RNAs
População de RNA em uma célula >100 000 moléculas de RNA
Classe RNA abundantes: 1% dos genes = 50% da pop. de RNAs
Classe de RNA raros: metade dos genes = 1% pop. de RNAs
Genoma funcional: outras metodologias
para identificar genes diferencialmente expressos
Limitações microarrays:
 Genes pouco expressos não são detectados
 Difícil separação da contribuição de diferentes isoformas de um mesmo gene
Outros métodos
Subtração de bibliotecas
PCR supressivo
mRNA fingerprint
cDNA-AFLP
CAP Trapper
Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos
Subtração de bibliotecas de cDNA
sistema utilizando biotina, streptavidina
e partículas magnéticas
Tester: biblioteca de cDNA aonde estão os
genes que quero fisgar meu gene (gene
induzido peloetileno:: tratamento com etileno)
Driver: biblioteca de cDNA aonde não estão os
genes que quero fisgar meu gene (genes não
induzidos pelo etileno:: tratamento sem etileno)
Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos
PCR supressivo
PCR supressivo
PCR supressivo
Sequência
não forma est. pan em moléculas
maiores, só em menores
SUPRESSION PCR
Differential RNA display
Gene 1
GCUAAAGCGA
Primer decâmero
randômico
Reação de PCR
com baixa temperatura
de anelamento,
Gene 2
AAAAAAAA
TTTTTT
Primer OligodT
AAAAAAAA
com nucleotídeos marcados
radioativamente
GCUAAAGCGA
Primer decâmero
randômico
TTTTTT
Primer OligodT
Gene 3
GCUAAAGCGA
2 dias
Primer decâmero
randômico
GCUAAAGCGA
TTTTTT
GCUAAAGCGA
TTTTTT
TTTTTT
GCUAAAGCGA
Gel de poliacrilamida e uréia (sequenciamento)
Condição 1
Condição 2
Gene mais expresso na condição 1
Gene mais expresso na condição 2
Gene somente expresso na condição 2
AAAAAAAA
TTTTTT
Primer OligodT
Criticismos
Pouca capacidade para detectar RNA raramente expressos
Banda do gel: mistura de cDNAs: 50-75% bandas = falsos positivos
Artefatos: primers curtos e baixa temp. anelamento: amplificação inespecífica
Limitada quantitividade: competição pelos primers por transcritos de diferentes abundâncias
Primers curtos: semi-pareamento em outras regiões do mesmo gene:dif. Clones positivos
podem ser o mesmo gene
Fragmentos pequenos (150-400 bp) contendo principalmente região 3’ UTR: difícil identific.
Modificações do método original
Primers mais longos com programa com ciclo alterado
Combinação com subtração
Arbitrary primed PCR (RAP-PCR): dois primes curtos: probl. Falsos positivos
Integração do protocolo para PCR de longa distância no Differential display (até 2Kb- LDD-PCR)
EcoR I+CC and Mse I+AAA).
Ecotipos de A.thaliana:
 linhas 1 and 2.Columbia;
 linhas 3 and 4. Landsberg.
Genótipo: Columbia,
Usando primer EcoR I+AC e:
Mse I primer+AA (lanes 1 and 2);
Mse I primer+AAA (lanes 3 and 4).
Introdução de um novo nucleotídeo
Levou a amplificação de um outro subgrupo
de cDNAs
Uso em larga escala do cDNA-AFLP
Sinchronized tobacco cells ( 12 point into S and M→G1 transition were
sampled.
Exhaustive cDNA-AFLP: 360 AFLP primer combinationsÇ 18,000 AFLP tags
About 10% exhibited a modulated cell cycle profileÇ 1150 AFLP tags
 Tobacco BY2 cells were synchronised in the G1→S transition phase using
Majority of these AFLP tags either match genes of unknown function or
represent novel sequences.