Bacilos Gram negativos nãofermentadores de glicose
Keite Nogueira
Importância clínica
• As bactérias que compõem o grupo de BGN-NF
são consideradas oportunistas.
• Têm grande importância clínica em casos de
infecções relacionadas à assistência à saúde,
principalmente em:
- unidades de terapia intensiva;
- pacientes submetidos a procedimentos invasivos;
- unidades de queimados;
- em infecções do trato respiratório de pacientes
com fibrose cística (FC).
Importância clínica
• Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii
estão entre as bactérias mais isoladas em
hemoculturas e amostras do trato respiratório de
pacientes sob regime de internação hospitalar.
• No entanto, os demais BGN-NF representam um
percentual pequeno de isolados, quando comparados
com outros agentes etiológicos, mas alguns deles
apresentam resistência elevada a vários
antimicrobianos (Complexo B. cepacia e S. maltophilia)
e são capazes de causar infecções graves.
Importância clínica
• A prevalência de BGN-NF no trato respiratório
de pacientes portadores de fibrose cística, tais
como Complexo Burkholderia cepacia,
Stenotrophomonas maltophilia e
Achromobacter xylosoxidans subespécie
xylosoxidans, tem aumentado nos últimos
anos e pode evoluir como colonização
persistente e sérios danos pulmonares.
Isolamento
• A amostra clínica deve ser enviada imediatamente ao
laboratório clínico após a coleta.
• Em casos onde não é possível o envio ao laboratório
em no máximo até 2 horas, manter a amostra
refrigerada.
• Amostras coletadas em swab podem ser colocadas em
meio de transporte tipo Cary-Blair.
• Amostras de sangue devem ser imediatamente
inoculadas em frascos apropriados para hemocultura.
A
• mostra de escarro muito viscoso deve ser previamente
tratada com N-acetil-L-cisteína a 0,5%.
Isolamento
• Meios de cultura necessários para o primo isolamento:
- Ágar sangue;
- Ágar MacConkey;
- Meios seletivos para amostras provenientes de pacientes
com fibrose cística, tais como ágar B. cepacia e meios
seletivos para Stenotrophomonas maltophilia.
• Observação:
• Os meios de cultura devem ser incubados entre 35ºC e
37ºC, em aerobiose por 24 a 48 horas.
• Geralmente apresentam bom crescimento, mas para a
cultura de pacientes com FC, às vezes é necessário
incubação por até 5 dias
Identificação
• Triagem inicial
• As características das colônias após incubação
devem ser observadas macroscopicamente
quanto ao tamanho, forma, consistência, cor,
produção de pigmento, presença ou ausência de
reações hemolíticas em ágar sangue e presença
ou ausência de crescimento em ágar MacConkey.
Importante também observar o crescimento com
24 a 72 h de incubação, em meios Trypticase Soy
Agar (TSA) e MacConkey, devido ao crescimento
lento de alguns BGN-NF.
B. cepacea
S. maltophilia
A. baumannii
Shewanella spp.
P. aeruginosa
Identificação
1. A partir de uma colônia isolada, em cultura pura com 24 a 72
horas de crescimento, proceder à semeadura em:
•Meio para diagnóstico presuntivo: Triple Sugar Iron (TSI), EPM - Mili
ou IAL (Rugai modificado);
•Meio sem adição de corantes para verificar pigmento e manter o
inóculo: Trypticase Soy Agar (TSA) inclinado ou ágar comum
inclinado;
•Caldo para verificar o Gram e a motilidade em lâmina: Trypticase
Soy Broth (TSB), ou caldo comum.
2. Incubar a 30ºC por 16 a 48 horas e em seguida realizar a
coloração de Gram, oxidase e a motilidade em lâmina a fresco.
3. O crescimento pode ser observado até 72 horas pelo fato de
alguns BGN-NF crescerem mais lentamente.
Identificação
• Semeadura, leitura e interpretação das provas
para triagem inicial
A - TSI ou IAL
- Semear com agulha, picando até o fundo do
tubo, e estriar a superfície do meio.
- Leitura:
• TSI: meio permanece inalterado, vermelho
(alcalino), no ápice e na base.
• IAL: meio inalterado e crescimento no ápice
(pode ser observado pigmento).
Identificação
B - Oxidase
- Umedecer um papel de filtro, colocado no interior de uma
placa de Petri, com solução de oxalato de paminodimetilanilina a 1% (mais sensível que as tiras);
- A partir do crescimento em TSA, esfregar uma alçada da
massa bacteriana, no papel de filtro umedecido, com alça
descartável ou de platina, pois a alça de níquel-cromo produz
uma reação falso-positiva;
- A leitura é feita em 15 segundos a 1 minuto.
Identificação
C - Motilidade
- Colocar uma gota do caldo TSB ou outro caldo com
crescimento bacteriano (16 a 48 horas a 30ºC) em uma
lâmina nova;
- A leitura tem que ser rápida porque os BGN-NF são
aeróbios, portanto a sobrevivência dos mesmos na
lamínula é curta.
- Leitura:
• Motilidade negativa: movimentos vibratórios fracos ou
ausência de movimento;
• Motilidade positiva: presença de bactérias cruzando o
campo em diferentes direções, sugerindo flagelo polar, ou
bactérias girando em torno de si mesmas, sugerindo flagelo
peritríqueo.
Identificação
D - Coloração de Gram
- Observar a morfologia das células
bacterianas, sua disposição e as suas
características tintoriais
Identificação
• Identificação bioquímica após a triagem inicial
- A partir do tubo de TSA inclinado ou ágar comum, preparar uma
suspensão bacteriana em solução salina 0,85% estéril, ou água
destilada estéril, correspondente à escala 0,5 - 1,0 de McFarland.
1- OF ou MEVAG
• Semeadura: Inocular 2 a 3 gotas da suspensão bacteriana em:
• Tubo OF ou MEVAG (Meio para o Estudo da Via de Ataque aos
Glicídeos) adicionados assepticamente com uma solução aquosa
estéril de glicose com concentração final de 1%;
• Os tubos são conservados em banho-maria a 56ºC até o momento
da inoculação bacteriana;
• Em um dos tubos adiciona-se assepticamente uma camada de
vaselina líquida estéril, dando condições anaeróbias.
Identificação
2- Provas complementares: tubos OF ou MEVAG adicionados
assepticamente com uma solução aquosa estéril de
adonitol, inositol, lactose, maltose, manitol, sacarose,
trealose e xilose (concentração final de 1%);
3- Tubos contendo os aminoácidos lisina descarboxilase e
arginina de-hidrolase. Os tubos devem ser incubados em
condições anaeróbias, colocando-se uma camada de óleo
mineral ou vaselina líquida estéril sobre o caldo;
4- Caldo nitrato e caldo nitrato com tubo de Durhan invertido;
5- Pseudomonas ágar P (piocianina) e Pseudomonas ágar F
(fluoresceína ou pioverdina);
6- Caldos TSB: incubar a 4ºC e 42ºC.
Identificação
• 7- ágar citrato de Simmons;
• 8- Utilizar os resultados do antibiograma para avaliar os
discos de polimixina e imipenem;
9- A partir do crescimento bacteriano em TSA, utilizando a
alça de níquel-cromo ou descartável, semear em:
- Meio uréia-indol: inóculo denso;
- Placa de ágar cetrimide, em estrias;
- Inocular em forma de botão as placas contendo ágar
DNase, ágar gelatina e ágar lipase;
- Ágar esculina, fazendo estrias na superfície;
- TSA com 1% de lactose, fazendo estrias na superfície.
• Após a semeadura, todos os meios são incubados a 30ºC
por 16 a 24 horas, com exceção das placas de ágar MüellerHinton com os discos de polimixina e imipenem, que serão
incubadas a 35ºC, e dos tubos de TSB para verificar o
crescimento em diversas temperaturas.
Identificação
• MEVAG:
Distinguem-se 3 tipos de bactérias:
• Fermentativas: a acidificação é rápida e igual nos dois
tubos (com e sem vaselina), tornando-os amarelos. Ocorre
ou não a produção de gás.
• Oxidativas: moderada acidificação na superfície do tubo
aberto (amarelo) e pouca ou nenhuma acidificação no tubo
fechado (mantém a cor do meio).
• Inertes ou Alcalinas: pouca ou nenhuma acidificação no
tubo fechado (mantém a cor do meio) e nenhuma
acidificação ou uma alcalinização mais ou menos forte na
superfície do tubo aberto (OF produz coloração azulada e
MEVAG um rosa mais intenso).
Identificação
• Aminoácidos lisina, arginina:
Os tubos testes devem ser comparados com o
tubo controle negativo para interpretação dos
resultados. A leitura pode ser realizada até 72 h,
se não positivar antes.
• Reação positiva: intensificação da cor púrpura do
meio: indica uma reação positiva devido à
liberação de enzimas por descarboxilação /
hidrólise com aumento de pH do meio.
• Reação negativa: o tubo mantém a cor púrpura
original.
Identificação
•
•
Redução de nitrato:
O teste é revelado através da adição de 3 gotas do reativo de Griss A com 3 gotas
do reativo de Griss B no caldo nitrato.
•
O desenvolvimento de uma coloração vermelha dentro de 1 a 2 minutos indica a
presença de nitrito e, portanto, um teste positivo.
Não ocorrendo a coloração vermelha:
O nitrato não foi reduzido, ou
O nitrato foi reduzido a nitrito e este, reduzido a gás nitrogênio livre.
Nestes casos, adiciona-se uma pitada de zinco em pó. Se o nitrato ainda estiver
presente, este será reduzido pelo zinco e uma coloração vermelha aparecerá
dentro de 5 a 10 minutos, indicando que não houve a redução de nitrato a nitrito,
portanto teste negativo. Se ocorrer a redução de nitrato a nitrito e este a
nitrogênio livre, a cor não se altera.
Nitrato com Durhan:
Pode-se observar a produção ou não de gás no interior do tubo de Durhan
invertido.
•
•
•
•
•
•
Identificação
• Pseudomonas ágar P e Pseudomonas ágar F:
• Estes meios se destinam a favorecer a síntese da piocianina
(ágar P) e da pioverdina ou fluoresceína (ágar F). A
piocianina se manifesta corando o meio de cultura de azulesverdeado, enquanto que a pioverdina o cora em verde
fluorescente;
• Pseudomonas aeruginosa é a única espécie conhecida de
bactéria que produz a piocianina;
• Fluoresceína ou pioverdina (F) pode ser produzida por P.
aeruginosa, P. fluorescens e P. putida.
• Para confirmar a presença da piocianina, pode-se colocar
de 1 mL a 2 mL de clorofórmio em contato com o meio de
cultura. A piocianina é solúvel em clorofórmio e o meio
torna-se azul. A pioverdina é um pigmento não solúvel em
clorofórmio.
Identificação
Caldo TSB para verificar o crescimento a 4ºC e
42ºC:
• Reação positiva: ocorre a turvação do meio.
• Reação negativa: não se observa a turvação do
meio.
• Ágar citrato de Simmons:
• O teste do citrato de Simmons é indicado para determinar a
capacidade de certas bactérias de utilizarem o citrato como
única fonte de carbono para o seu metabolismo;
• O ágar citrato de Simmons contém citrato de sódio como
única fonte de carbono, fosfato de amônia como única
fonte de nitrogênio e o azul de bromotimol como indicador
de pH;
• Quando a bactéria utiliza o citrato, este é removido do
meio e CO2 é liberado. O CO2 combina-se com o sódio, do
citrato de sódio e água para formar carbonato de sódio, um
produto alcalino. Isto aumenta o pH, mudando a cor do
meio de verde (negativo) para azul (positivo).
• Discos de polimixina e imipenem:
• Polimixina: ausência do halo, Complexo
Burkholderia cepacia é intrinsecamente
resistente;
• Imipenem: ausência do halo,
Stenotrophomonas maltophilia é
intrinsecamente resistente.
• Meio uréia-indol:
• Esse meio permite a pesquisa simultânea da urease e da produção de
indol:
• A atividade da urease é detectada pelo crescimento da bactéria em meio
contendo uréia e usando um indicador de pH, vermelho de fenol. Quando
a uréia é hidrolisada, a amônia se acumula no meio e o torna alcalino.
Ocorre aumento no pH, causando a mudança de cor no indicador de
amarelo para rosa pink, indicando uma reação positiva.A ausência de
mudança na coloração indica um teste negativo (Figura 17);
• O teste do indol determina a capacidade de certas bactérias que possuem
a enzima triptofanase de degradar o triptofano, produzindo indol, ácido
pirúvico e amônia. A presença de indol pode ser detectada pela adição do
Reativo de Kovacs, ocorrendo a formação de um anel de coloração
vermelho na superfície do meio, indicando uma reação positiva. A
ausência de mudança de cor indica que o triptofano não foi hidrolisado e,
portanto, a reação é negativa conforme observado na Figura 18.
• Hidrólise da esculina:
• O produto hidrolisado reage com o composto
férrico do meio proporcionando um precipitado
negro intenso nas provas positivas, podendo ser
observado a partir de 6 horas de incubação até
48 horas;
• A coloração castanho-escura é considerada prova
negativa;
• A cor é devida à produção de pigmentos por
alguns BGN-NF.
• Hidrólise da gelatina:
• O teste determina a habilidade de um organismo
produzir enzimas proteolíticas, a gelatinase que
liquefazem a gelatina;
• No teste positivo, observa-se um halo leitoso ao
redor do inóculo. Se houver dificuldade de
visualização do halo, deve-se acrescentar 1 mL a
2 mL de reativo de Frazier ou HCl 1N, banhar a
placa e retirar o reativo. Nota-se uma zona
transparente ao redor do inóculo produtor de
gelatinase
Identificação
• Hidrólise do Tween 80 – Pesquisa da lipase:
• No teste positivo, observa-se uma zona de
precipitação ao redor do inóculo.
Identificação
• Ágar DNase:
• Teste para determinar a capacidade de um organismo
produzir a enzima DNase, que é capaz de degradar o DNA;
• Este meio pode conter um corante metacromático
denominado Azul de Toluidina O (TBO). Quando o DNA é
hidrolisado, o TBO é complexado, resultando numa
coloração pink ao redor do inóculo, determinando uma
reação positiva;
• Nos meios que não contêm o corante, deve-se adicionar
HCl 1N. A reação positiva apresenta um halo transparente
em volta do inóculo, enquanto o restante do meio fica
leitoso.
ONPG
• TSA com 1% de lactose - Prova da ß
galactosidase – ONPG:
• A presença ou ausência da atividade da
enzima ß-galactosidase é demonstrada
quando se emprega o composto orgânico –
ONPG.
• Numa reação positiva, o reativo ONPG que é
incolor, é hidrolizado liberando um composto
cromogênico amarelo, o orto-nitrofenil.
Identificação
• Coloração de flagelos é uma prova
complementar utilizada, se necessário.
• Para a visualização da disposição e número de
flagelos (polar único, polar >1, peritríqueo).
Identificação
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Principais semelhanças entre S. maltophilia e Complexo B. cepacia:
Reação de oxidase lentamente positiva;
Móveis;
Lisina positiva;
Hidrólise da esculina variável.
Principais diferenças:
- S. maltophilia
Produzem DNase;
Imipenem R;
Oxidam a maltose rapidamente (antes da glicose).
- Complexo B. cepacia
Não produzem DNase;
Polimixina R;
Oxidam a maioria dos açúcares.
Resistência
• Em geral, os BGN-NF apresentam uma alta
resistência aos antimicrobianos.
• Os principais problemas em BGN-NF são a
resistência aos carbapenêmicos, que pode ser
devida a diversos mecanismos de resistência, tais
como:
• Produção de ß-lactamases (metalo-ßlactamases);
• Perda de porina;
• Bomba de efluxo
Resistência
• P. aeruginosa produtora de metalo-ß-lactamases tem sido
detectada em diversas partes do mundo.
• Complexo B. cepacia é intrinsecamente resistente a agentes
antimicrobianos, incluindo ß-lactâmicos, exceto
carbapenêmicos
• S. maltophilia é intrinsecamente resistente aos ßlactâmicos, inclusive carbapenêmicos, devido à produção
de ß-lactamases e baixa permeabilidade da membrana
celular.
• Um dos grandes problemas no ambiente hospitalar é a
multi-resistência apresentada por algumas cepas de
Acinetobacter baumannii, alguns sensíveis apenas à
polimixina.
• Chryseobacterium também apresentam resistência à
polimixina B.