ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
DE ÁGUA E ALIMENTOS
Análise de alimentos
Utilização de técnicas microbiológicas:
Pesquisar
Estimar
presença de microrganismos;
número de microrganismos;
Identificar
os microrganismos.
Microrganismos estressados
A detecção é feita pelo cultivo dos
microrganismos em meios seletivos e não
seletivos.
Os microrganismos isolados de alimentos
geralmente são submetidos a condições de
injúria,
tais
como
aquecimento,
refrigeração, conservantes, congelamento,
desidratação, acidificação, salga, que irão
afetar as células presentes.
Efeitos sobre os microrganismos:
 aumento
da fase LAG
 maior sensibilidade aos agentes do
meio de cultivo
 lesão na membrana citoplasmática
 lesão em enzimas do ciclo de Krebs
 deterioração de ribossomas
 lesão do DNA
 perda de componentes celulares
 incapacidade de multiplicação
Etapas da análise microbiológica
Amostragem;
Preparação da amostra;
Contagem de microrganismos;
Isolamento
e
identificação
microrganismos;
Sorologia.
de
Amostragem
Especificação de dados;
Evitar contaminação com outros alimentos;
Transporte:
 alimentos
perecíveis: 0-4ºC;
 alimentos congelados:
congelados;
Análise no máximo em 36 horas.
Preparação da amostra
Homogeneização da amostra;
Cuidado: velocidade e tempo ⇒ evitar
aquecimento da amostra e danos aos
microrganismos;
Melhor método: Stomacher.
Contagem de Microrganismos
MÉTODOS DIRETOS:
1) Contagem em placa;
 Método de filtração:
 Método do Número Mais Provável
 Contagem direta ao microscópio:
 Contador Coulter:
Contagem de Microrganismos
MÉTODOS INDIRETOS:
1)
2)
3)
4)
Peso seco
Medida de turbidez
Atividade metabólica
Microcalorimetria
Isolamento e Identificação de
Microrganismos
Características morfológicas
Morfologia bacteriana = diz pouco sobre
as células;
Útil na identificação de algumas bactérias
= endoesporos, flagelos, cápsula
Coloração diferencial
Coloração de Gram;
GP
Coloração de Ziehl-Neelsen;
Coloração de esporos.
GN
BACTÉRIAS
GRAM-POSITIVAS
BACTÉRIAS
GRAM-NEGATIVAS
Células fixadas à
lâmina
COLORAÇÃO
DE GRAM
Corante principal
cristal violeta
Cora em púrpura
Cora em púrpura
Mordente:
solução de iodo
Permanece púrpura
Permanece púrpura
Descorar com:
álcool ou acetona
Permanece púrpura
Contratingir com
Safranina
Permanece púrpura
Cora em vermelho
Testes bioquímicos
Atividade metabólica = utilizada para
diferenciar bactérias;
Bactérias intimamente relacionadas =
separadas por testes bioquímicos;
Reduzir o tempo:
 Uso
de técnicas seletivas:
 Utilização de meios seletivos e diferenciais
e diferentes condições de cultivo;
 Utilização de testes rápidos.
Meios seletivos e diferenciais
EMB = identificação de E. coli
Ágar sangue = halo de hemólise
Meios seletivos e diferenciais
Ágar Baird Parker = identificação
de S. aures
Ágar MYP = identificação de
B. cereus
Testes rápidos = API 20E
Testes rápidos = tubos de
compartimentos
Testes rápidos
Contagem de Microrganismos Aeróbios
Mesófilos
Pesar a amostra;
Fazer as diluições;
Plaqueamento:
 Superfície;
 Profundidade;
Meio utilizado: PCA
Preparação da amostra
Homogeneização e Diluição
25 g
1mL
225mL H2O
peptonada 0,1%
10-1
1mL
9mL H2O
pept. 0,1%
10-2
9mL H2O
pept. 0,1%
10-3
Método de
Profundidade
Método de
Superfície
Resultados em placas
Contagem de Bactérias Aeróbias
Mesófilas: Método Profundidade
10-1
10-2
1,0 mL
10-3
1,0 mL
Ágar Padrão de Contagem (PCA)
1,0 mL
Contagem e Identificação de
Staphylococcus aureus: Método Superfície
10-1
10-2
0,1 mL
10-3
0,1 mL
Ágar Baird Parker (BP)
0,1 mL
CONTAGEM DE Staphylococcus aureus
Diluições
Baird-Parker
AN
IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus aureus
TESTE CATALASE
H2O2
BOLHAS
AN
H2O2
ESFREGAÇO
CATALASE
H 2O + O 2
IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus aureus
TESTE DNase e COAGULASE
DNase
COAGULASE
Protrombina
Fibrinogênio
COAGULASE
Trombina
Fibrina
Pesquisa de Salmonella sp.
PRÉ-ENRIQUECIMENTO
H2O peptonada 1,0 %
ENRIQUECIMENTO
SELETIVO
Rappaport
Vassiliadis
Caldo
tetrationato
PLAQUEAMENTO
DIFERENCIAL
HE
SS
XLD
HE
SS
XLD
35 - 37ºC/24hs
IDENTIFICAÇÃO
Provas Bioquímicas
Importância da Análise de Água
Lavagem de matéria-prima;
Lavagem de utensílios;
Lavagem de superfícies;
Lavagem de carcaças;
Resfriamento;
Composição dos alimentos.
Qualidade da água
Garantida do mesmo modo que
matéria-prima ou ingrediente;
Programa de garantia de qualidade
fonte,
tratamento,
distribuição
armazenamento dentro da fábrica;
Inspeção = padrões internos e legais
Portaria 518 de 2004
a
=
e
=
Coleta de Água
Frasco limpo e estéril;
Sistema de distribuição = esperar 2 a 3
minutos, abrir o frasco, coleta a água e
fechar o frasco;
Rios, lagos, fontes = cuidado com água
parada e material flutuante;
Água com cloro = tiossulfato de sódio;
Análise = máximo 30 horas após coleta.
Análise da água
Não deve ser baseada no isolamento e
identificação de MOs patogênicos;
Microrganismos indicadores:
 Contagem em placas;
 Coliformes totais;
 Coliformes fecais.
Análise Microbiológica
Contagem de Coliformes totais e fecais:
Técnica
do Número Mais Provável
(NMP);
Técnica da membrana filtrante;
Técnica do Collilert (Teste do ONPG e
MUG).
Técnica do NMP
COLIFORMES TOTAIS
COLIFORMES TERMOTOLERANTES
IDENTIFICAÇÃO DE E. coli
Número Mais Provável de Coliformes Totais
e Termotolerantes (Fecais)
10mL
10mL LST
1mL
9mL LST
Lauril Sulfato Triptose (LST)
0,1mL
9,9mL LST
35-37ºC/24hs
Coliformes Totais
Caldo Verde Brilhante
Coliformes Termotolerantes
Caldo Escherichia coli
44,5-45,5ºC/24hs
Provas Bioquímicas
Agar Eosina Azul
de Metileno
Membrana Filtrante
Vantagem de cada método
Filtração:
 Rápido;
 Exato;
 Método
de esterilização a frio;
NMP:
 Recupera
microrganismos injuriados;
 Mais barato;
 Evita falso negativo.
Desvantagem de cada Método
Filtração:
 Maior
custo;
 Risco de perda de microrganismos, meio
seletivo;
 Só pode ser utilizado para água e
alimentos líquidos;
NMP:
 Demorado;
 Trabalhoso;
Colilert
Método Rápido – MUG e
ONPG
MUG e ONPG - Resultado
Meios utilizados – CONTAGEM
TOTAL DE MICRORGANISMOS
PCA (ÁGAR PADRÃO DE CONTAGEM)
 Triptona
5,0g
 Extrato de levedura 2,5g
 Dextrose 1,0g
 Ágar15,0g
 Água destilada 1,0L
PESQUISA DE Salmonella sp.
CALDO RAPPAPORT - VASSILIADIS
 Triptona
 Cloreto
de magnésio
 Cloreto de sódio
 Verde malaquita
 Fosfato de potássio
PESQUISA DE Salmonella sp.
CALDO TETRATIONATO
 Proteose
peptona
 Carbonato de cálcio
 Sais biliares
 Tiossulfato de sódio
 Água destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
AGAR Hectoen Enterico
 Proteose
peptona, Extrato de levedura
 Salicina, Sais biliares
 Lactose, Sacarose
 Tiossulfato de sódio
 Citrato férrico
 Cloreto de sódio
 Azul de bromotimol
 Fuccina ácida
 Ágar
 Água destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
AGAR SS (Salmonella/ Shigella)
 Extrato
de carne, Proteose peptona
 Citrato de sódio
 Sais biliares
 Tiossulfato de sódio
 Citrato férrico
 Vermelho neutro
 Lactose
 Ágar
 Água destilada1,0L
PESQUISA DE Salmonella sp.
ÁGAR CITRATO DE SIMMONS
 Citrato
de sódio
 Fosfato de amônia
 Sulfato de manganês
 Azul de bromotimol
 Cloreto de sódio
 Fosfato dipotássio
 Ágar
 Água destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
TSI (TRIPLE SUGAR IRON ÁGAR)
 Extrato de carne, Extrato de levedura
 Peptona, Proteose peptona
 Dextrose
 Lactose
 Sacarose
 Sulfato ferroso
 Tiossulfato de sódio
 Cloreto de sódio
 Vermelho de fenol
 Ágar
 Água destilada1,0L
PESQUISA DE Salmonella sp.
CALDO LISINA
 Peptona
de gelatina
 Glicose
 Extrato
de levedura
 Lisina
 Púrpura
de bromocresol
 Água destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
ÁGAR URÉIA
 Peptona
 Uréia
 Dextrose
 Cloreto
de sódio
 Fosfato monopotássio
 Vermelho de fenol
 Água destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
ÁGAR MIO (MOTILIDADE, INDOL, ORNITINA)
 Extrato de levedura
 Ornitina
 Peptona
 Púrpura de bromocresol
 Dextrose
 Triptona
 Agar
 Água destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
CALDO VERMELHO DE FENOL
 Proteose
peptona
 Extrato de carne
 Cloreto de sódio
 Vermelho de fenol
 Água destilada
CONTAGEM DE Staphylococcus
aureus
BP - BAIRD PARKER AGAR BASE
Triptona, Extrato de carne, Extrato de levedura
 Cloreto de lítio
 Piruvato de sódio
 Glicina
 Ágar
 Água destilada
Após esterilização, adicionar:
 Emulsão de gema de ovo, salina
 Telurito de sódio

CONTAGEM DE Staphylococcus
aureus
ÁGAR DNASE
 Peptona
caseína
 Ácido desoxirribonucléico
 Cloreto de sódio
 Agar
 Água destilada
CONTAGEM DE
Staphylococcus aureus
Teste de Catalase
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSE (LST)
 Triptose
 Cloreto
de sódio
 Lactose
 Lauril sulfato de sódio
 Fosfato de potássio dibásico
 Fosfato de potássio monobásico
 Água destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
CALDO VERDE BRILHANTE BILE 2%
 Peptona
 Bile
de boi
 Lactose
 Verde brilhante
 Água destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
CALDO Escherichia coli (EC)
 Triptose
 Cloreto
de sódio
 Lactose
 Sais biliares
 Fosfato de potássio dibásico
 Fosfato de potássio monobásico
 Água destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
AGAR EOSINA AZUL DE METILENO (EMB)
 Peptona
 Lactose
 Sacarose
 Fosfato
de potássio dibásico
 Azul de Metileno
 Eosina amarela
 Ágar
 Água destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
ÁGAR CITRATO DE SIMMONS
 Citrato
de sódio
 Fosfato de amônia
 Sulfato de magnésio
 Azul de bromotimol
 Cloreto de sódio
 Fosfato dipotássio
 Ágar
 Água destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
CALDO TRIPTONA
 Triptona
 Água
destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
ÁGAR MOTILIDADE
 Tripticase
 Fosfato
dissódico
 Glucose
 Extrato de levedura
 Ágar
 Água destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
CALDO VM/VP
 Peptona
 Fosfato
dipotásico
 Glicose
 Água
destilada
Interpretação dos resultados
Produtos
em
condições
sanitárias
satisfatórias:
b. PRODUTO OU LOTE DE ACORDO COM OS
PADRÕES LEGAIS VIGENTES.
Produtos
em
condições
sanitárias
insatisfatórias:
d. PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA
CONSUMO
HUMANO
POR
APRESENTAR.....
e. PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA
CONSUMO
HUMANO
POR
APRESENTAR....