Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado
Diretora Técnica
Instituto Paulista de Doenças Infecciosas e Parasitárias Laboratórios
Laboratório Central - HSP - UNIFESP
Métodos de Teste
de Sensibilidade aos
Antimicrobianos (TSA)
Beta Lactâmicos
GRUPOS:
Anel -lactâmico
Penicilina
Cefalosporinas
Monobactâmicos:
O
aztreonam
Carbapenêmicos:
Sítio de ação da -lactamase
imipenem
meropenem
ertapenem
Cefalosporinas
1a Geração
Cefazolin
2a Geração
Cefamandol
Cefonicid
Cefotetan
Cefoxitina
Cefuroxima
3a Geração
Cefoperazona
Cefotaxima
Ceftazidima
Ceftizoxima
Ceftriaxona
4a Geração
Cefepima
RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS
Aeróbios
Metronidazol
Natural ou intrínseca
ou Constitutiva
Anaeróbios
Adquirida
Plasmidial
Transmissível
Cromossômica
Produção: ßlactamases,
fosfotransferases,
hidrolases, redutases.
Resistência múltipla
Aminoglicosídeos
Mutação de genes
Resistência únicanão é transmitida de
célula para célula a
menos que o gene
esteja em integron
Evolução Clínica
Paciente
Imunidade
Microrganismo
Farmacologia
Teste de
sensibilidade
Antimicrobiano
Reprodução da descoberta de
Fleming
Reprodução da placa de Fleming para a
prova de sensibilidade aos antibióticos
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
METODOLOGIAS
Avaliação QUALITATIVA
 DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
Avaliação QUANTITATIVA
 DILUIÇÃO EM CALDO
Macrodiluição
Microdiluição
 DILUIÇÃO EM ÁGAR
 AUTOMATIZADOS
 ETEST
MACRODILUIÇÃO
Método quantitativo  MIC
g/mL
100
50
25
12.5
6.25
3.12
.16
 Conceito
 Precisão
 Vantagens
 Desvantagens
.8
.4
controle
MACRODILUIÇÃO EM CALDO
Determinação do MIC
12.5
6.25
3.12
g/mL
MIC
É a menor concentração inibitória mínima
que inibe completamente o crescimento
bacteriano.
MACRODILUIÇÃO
MIC
g/mL 100
MBC
50
25
12.5
6.25
• • •
• • •
3.12
.16
.8
••••
•••••
••••
.4
controle
MICRODILUIÇÃO
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR

Utilizado rotineiramente

Fácil execução

Flexibilidade na escolha dos antibióticos

Reprodutibilidade nos resultados

Padronização dos resultados

Baixo custo
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
Princípio do método
Teste de sensibilidade aos
antimicrobianos
Leitura e Interpretação
mm
DILUIÇÃO EM ÁGAR
Utilizado em estudos epidemiológicos
 Fácil execução
 Permite testar vários isolados simultaneamente
 Promove resultados quantitativos
 Permite o teste de bactérias fastidiosas
 Baixo custo (relativo)
Poucos isolados
 Preparo das placas e estocagem

DILUIÇÃO EM ÁGAR
Ágar com 6 g/mL de Vancomicina
Enterococcus spp.
S   4 g/mL
I

8-16 g/mL
R   32 g/mL
Diluição em Ágar - Desvantagens
Muito trabalhoso, tanto a preparação das placas
quanto a preparação do inóculo, especialmente
quando vários antimicrobianos devem ser
testados
As placas de ágar não podem ser armazenadas
por muito tempo
Helio Sader - LEMC
Etest
Princípio do método
Etest®Difusão
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Curva de regressão
100
50
25
MICs
(g/mL)
12
6.25
3.12
1.6
0.8
0.4
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Diâmetro de zona de inibição (mm)
Relação entre o MIC, Zona de inibição
e “Breakpoints”.
MIC  DIFUSÃO
100
50
25
12.5
6.25
3.12
.16
.8
.4
g/mL
30
50
25
12.5
6.25
3.12
18 mm
controle
Interpretação do Etest
Interpretação do Etest
Interpretação do Etest
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS
CLSI - antigo“NCCLS”
Organização internacional,
interdisciplinar e educacional que
promove o desenvolvimento e a
ampla utilização de normas e
procedimentos laboratoriais
padronizados.
A subcomissão do CLSI é composta
de representantes de profissões,
do governo e indústria, incluindo
laboratórios de microbiologia,
educadores, farmacêuticos, etc.
TESTE DE SENSISIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS
Padronização
 Processos Padronizados (POPs)
 Controle de qualidade dos itens:
meios (efeito timidina ou timina)
pH
temperatura
incubação
discos (ATCCs)
fitas de Etest
Teste de sensibilidade aos
antimicrobianos
Procedimento
Bactéria e Preparo do Inóculo
 Suspensão direta
 Método de crescimento
0,5 McFarland 1a 2x108 UFC/mL
Teste de sensibilidade aos
antimicrobianos
Procedimento
Bactéria e Inóculo
Bactéria recentemente isolada
Colônias bem isoladas
CRESCIMENTO BACTERIANO
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
MEIOS
1- Ágar Mueller-Hinton
2- Ágar Mueller-Hinton suplementado
3- Ágar GC
3- Haemophilus Test Medium (HTM)
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
MEIO MUELLER- HINTON
 Reprodutibilidade do teste.
 Baixo teor de inibidores de sulfonamidas, trimetoprim
e tetraciclinas.
 Permite crescimento satisfatório da maioria dos
patógenos.
 Grande número de dados e experiência com o meio.
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
O que devemos saber sobre os meios?
 Hidratar e autoclavar
 60 a 70 mL
150 mm
25 a 30 mL
90 mm
 pH
7.2 a 7.4
 Conservação
2 a 8oC
 Teste de esterilidade
4 mm
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
O que devemos saber sobre os meios?
 Umidade
 Efeito da Timidina ou Timina
Inibidores das sulfonamidas e trimetoprim.
 Conservação
2 a 8oC
 Teste de esterilidade
 Efeitos da variação de Magnésio e Cálcio
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
Discos
 Conservação
8oC ou 
freezer (não “frost free”)
Imipenem, Ertapenem Cefaclor e combinações de ác.clavulânico
 Retirar do refrigerador ou do freezer até
2 horas antes do uso
 Evitar umidade
 Data de validade
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Seleção dos antibióticos

Laboratório Clínico

Infectologistas

Comissão de Infecção Hospitalar

Comissão de Controle de Antimicrobianos

Farmácia
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Quando e porquê realizar o antibiograma?

Isolado requer terapia antimicrobiana

Isolado cuja susceptibilidade não é preditiva

Isolado capaz de exibir resistência

Orientação terapêutica

Permite individualizar padrões de resistência
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Procedimento
Inóculo
Métodos:
 Crescimento
 Suspensão direta
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Procedimento
Inóculo - Método do crescimento
 3 a 5 colônias
4 a 5 mL de TSB
 Incubar a 35oC - (2 a 6h)
 Ajustar a turbidez
0,5 McFarland
1a 2x108 UFC/mL
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Procedimento
Inóculo - Suspensão direta
 3 a 5 colônias
 Ajustar a turbidez
0,5 McFarland
1 a 2 x 108 UFC/mL
 Estabilizar 15 min.
4 a 5 mL de TSB ou salina
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Procedimento
Inóculo
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Procedimento
Inoculação
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Procedimento
Inoculação
 Superfície do ágar não deve estar úmida
 Inoculação homogênea
 Esperar diminuir a
umidade antes da
aplicação dos discos
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Procedimento
Aplicação dos discos
 Bateria pré determinada
 Aplicar e pressionar o disco
 Aplicar no máximo
12 discos na placa de 150mm
5 discos na placa de 90mm
 Inverter a placa e incubar 15
minutos após a aplicação
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Procedimento
Incubação
 Temperatura
 Atmosfera
35oC
atm ambiente
exceção Haemoplilus spp., N. gonorrhoeae e
estreptococos
CO2
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Leitura e Interpretação
TESTE DE SENSIBILIDADE
AOS ANTIMICROBIANOS
O que testar?
Como interpretar?
“CLSI-2005 ”
A lista de cada
microrganismo
Quais são os antibióticos devemos utilizar?
Grupo A:
1ª escolha - testados e
reportados
Grupo B:
1ª escolha - testados e
reportados seletivamente
Grupo C:
suplementares e reportados
seletivamente
comportamento
Grupo U:
testados em isolados de urina
aceitável nas
Grupo O:
outros não rotineiramente
utilizados
compreende
agentes de eficácia
comprovada e que
tem um
provas in vitro.
Grupo inv: em investigação
“CLSI”
 Recomendações na escolha dos antimicrobianos
 Padronização das técnicas
 Critérios para a interpretação dos resultados
 Parâmetros para o controle qualidade do teste.
Interpretação do Resultado
Susceptível (S)
A categoria susceptível implica que a infecção
causada pela cepa bacteriana isolada pode ser
adequadamente tratada com a dosagem do
antimicrobiano recomendada para o tipo de
infecção e o agente infeccioso.
Desde que não haja contra indicação.
Interpretação do Resultado
Intermediária (I)
A categoria intermediária inclui isolados
cujos MICs são próximos aos do sangue e
tecidos. Ela permite a aplicabilidade do
antimicrobiano em infecções em sítios onde
as drogas são fisiologicamente
concentradas ou quando doses maiores
podem ser utilizadas.
Interpretação do Resultado
Resistente (R)
A categoria resistente inclui isolados que não
são inibidos pelas concentrações usuais do
antimicrobiano na dosagem padrão e/ou falha
quando um específico mecanismo de
resistência é expressado.
Avaliação da Sensibilidade
Streptococcus pneumoniae
 Mueller-Hinton agar com 5% de sangue de carneiro
 Inóculo
 suspensão direta, 0,5 McFarland
 Incubação
 35oC ± 2o em atm. 5% CO2
 Leitura
 20 a 24h
 Controle de qualidade  S.pneumoniae ATTC* 49619
CLSI, M100-S15, 2005
Avaliação da Sensibilidade
Streptococcus pneumoniae
 Escolha dos discos  Tabela 2G
Oxacilina  Penicilina
não recomendado para outros estreptococos
 Diâmetros de inibição específicos (Tabela 2G)
 Interpretação
Oxacilina
 20 mm  Sensível
 19 mm
MIC
penicilina, meropenem e ceftriaxona ou cefotaxima
CLSI, M100-S15, 2005
Streptococcus pneumoniae
CLORANFENICOL
3
ERITROMICINA
1
Azitromicina
Claritromicina
Ampicilina, Amoxacilina,
OFLOXACINA
OXACILINA 1g  PENICILINA 1
RIFAMPICINA
3
GATIFLOXACINA
3
SULFA/TRIMET
1
VANCOMICINA
2
 20mm
S
Levofloxacina
Moxifloxacina
< 17 mm
19 mm
amoxacilina/ác.clav.
ampicilina/sulb.,
cefaclor, cefepima,
cefotaxima, ceftriaxona,
cefuroxima, imipenem e
meropenem
MIC
Penicilina
Meropenem
Ceftriaxona
CLSI, M100-S15, 2005
Avaliação da Sensibilidade
Streptococcus spp.
 Mueller-Hinton agar com 5% de sangue de carneiro
 Inóculo
 suspensão direta
 Incubação
 35oC ± 2o em atm. 5% CO2
 Leitura
 20 a 24h
 Controle de qualidade  S.pneumoniae
ATTC* 49619
CLSI, M100-S15, 2005
Avaliação da Sensibilidade
- Enterococos
 Ágar Mueller-Hinton
 Inóculo
 crescimento ou suspensão direta
 Incubação 35oC ± 2o em atm. ambiente
 Leitura
 16 a 18h,
24h para Vancomicina  R
MIC
CLSI, M100-S15, 2005
Enterococcus resistente à
Vancomicina (VRE)
1º Isolado
final dos anos 80
30 anos após
Vancomicina
> 20% das infecções
pelo Enterococo
Enterococcus resistente à
Vancomicina (VRE)
Resistência Intrínseca
Enterococcus gallinarum e E. casseliflavus
Resistência adquirida
Enterococcus faecium e E. faecalis
Detecção do pigmento - Enterococcus spp.
BHIA
E. faecium
E. faecalis
E. gallinarum
Pigmento amarelo
Sim
Motilidade 30ºC
Positivo
Negativo
E. mundii
E. casseliflavus
Avaliação da sensibilidade
dos Enterococcus spp.
S
Imipenem
E. faecalis
Penicilina
S
AMPICILINA
1
CIPROFLOXACINA
U
CLORANFENICOL
3
GENTAMICINA 120 g
3
Amoxicilina, Amoxacilina/ác.clav.,
ampicilina/sulbactan, piperacilina e
piperacilina/tazobactan.
STREPTOMICINA 300 g
3
Para cepas não produtoras de  lactamases
TEICOPLANINA
VANCOMICINA
24 h de incubação
2
15-16 mm 
MIC
QUINUPRISTIN/DALFOPRISTIN 2
Detecção de  lactamases
+
R Penicilina
Sinergismo positivo
Sinergismo negativo
7-9 mm 
MIC
E. faecalis ATTC® 29212
CLSI.M100 -S15, 2005
VRE
+
–
Avaliação da Sensibilidade
Estafilococos
 Ágar Mueller-Hinton
 Inóculo
 suspensão direta
 Incubação
 33 a 35oC em atm. ambiente
 Leitura
 16 a 18
24h  Oxacilina/Cefoxitina e Vancomicina
MRSA e MRS
CLSI, S15, 2005
Staphylococcus
não aureus
Staphylococcus
aureus
CIPROFLOXACINA
CLINDAMICINA
ERITROMICINA
GENTAMICINA
3
2
2
3
OXACILINA 1g
1
CEFOXITINA
PENICILINA
1
SULFA/TRIMET
2
TEICOPLANINA
VANCOMICINA
2
Quinupristin/Dalfopristin 3
LINEZOLIDA
3
Gene mec A
Levofloxacina
Ofloxacina
Azitromicina
Claritromicina
Rotineiramente não são
reportado em urina
<14mm  MIC
MRSA
CIPROFLOXACINA
CLINDAMICINA
ERITROMICINA
GENTAMICINA
3
2
2
3
OXACILINA 1g
1
CEFOXITINA
PENICILINA
1
SULFA/TRIMET
2
TEICOPLANINA
VANCOMICINA
2
Quinupristin/Dalfopristin 3
LINEZOLIDA
3
MRS
As penicilinas, cefens e outros  lactâmicos como
amoxi/ác.clav., ampi/sulb., ticarcilina/ác.clav. e carbapenems
Oxa s e PS  S
Oxa s e PR   lactamase
Oxa R  PR
CLSI, S15, 2005
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL
LABORATORY STANDARDS “NCCLS”- 2001
Staphylococcus spp.
Vancomicina
 halo  14 mm
MIC
Incubação por 24horas a 33 a 35°C
 MIC  4 g
Encaminhar a
Laboratório de Referência
Detecção do VISA e VRSA
Diluição
em ágar
BHIA 6 g/mL
Vancomicina
Detecção do VISA e VRSA
E-test
Avaliação da Sensibilidade
Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas
maltophilia e Burkholderia cepacia
 Ágar Mueller-Hinton
 Inóculo
 método do crescimento ou suspensão direta
 Incubação 35oC ± 2o em atm. ambiente
 Leitura
 16 a 18h
S. maltophilia e B. cepacia
P. aeruginosa na Fibrose cística
 20 a 24 horas
 Controle de qualidade  P. aeruginosa ATTC* 27853
 E. coli ATTC* 35218
 E. coli ATTC* 25922
CLSI.M100 -S15, 2005
Pseudomonas aeruginosa
AMICACINA
TOBRAMICINA
GENTAMICINA
CEFEPIMA
CEFTAZIDIMA
CIPROFLOXACINA
IMIPENEM
MEROPENEM
PIPERACILINA
TICARCICINA
PIPE/Tazo
TICARC/ Ác.clav.
POLIMIXINA
2
2
1
2
1
2
2
2
1
1
O
O
Cefotaxima
Levofloxacina
Acinetobacter spp.
AMICACINA
GENTAMICINA
AMPICILINA/Subac.
CEFEPIMA
CEFTAZIDIMA
CEFTRIAXONA
CIPROFLOXACINA
IMIPENEM
MEROPENEM
PIPERACILINA
TICARCICINA
PIPE/Tazo
TICARC/ Ác.clav.
POLIMIXINA
Pode ser reportado quando
a cepa for resistente
2
1
2
1
3
2
2
2
1
1
O
O
CLSI,M100 -S15, 2005
Stenotrophomonas maltophilia
Burkholderia cepacia
LEVOFLOXACINA
2
CEFTAZIDIMA
1
MINOCICLINA
0
MEROPENEM
2
TRIMETOPRIM SULFAMETOXAZOL 3
MINOCICLINA
0
TRIMETOPRIM SULFAMETOXAZOL 3
CLSI.M100 -S15, 2005
Avaliação da Sensibilidade
Enterobactérias
 Ágar Mueller-Hinton
 Inóculo
 método de crescimento e suspensão direta
 Incubação 35oC ± 2o em atm. ambiente
 Leitura
 16 a 18h
 Controle de qualidade  E. coli ATTC* 25922
 E. coli ATTC* 35218
NCCLS.M100 -S15, 2005
Enterobactérias
AMICACINA
2
AMPICILINA
1
AMPICILINA/Sulbactan
2
AZTREONAM
3
CEFALOTINA
1
CEFEPIMA
2
CEFTAZIDIME
3
CEFOXITINA
2
CEFTRIAXONA
2
CIPROFLOXACINA
2
GENTAMICINA
1
IMIPENEM
2
ERTAPENEM
2
PIPERACILINA/Tazobactan 2
SULFA/TRIMET
Amoxacilina
Amoxacilina/ác.clavulânico
Cefotaxima
Levofloxacina
Meropenem
2
TICARCILINA/Äc.clavulânico2
CLSI.M100 -S15, 2005
Avaliação da Sensibilidade
Haemophilus spp
 Ágar Haemophilus Test Medium (HTM)
 Inóculo
 suspensão direta
 Incubação  35oC em atm. 5% CO2
 Leitura
 16 a 18h
 Controle de qualidade  H. influenzae
ATTC* 49247
 H. influenzae ATTC* 49766
 E. coli ATTC* 39218
NCCLS.M100 -S15, 2005
Avaliação da Sensibilidade
Haemophilus spp
 Ágar Haemophilus Test Medium
 Inóculo
 suspensão direta
 Incubação  35oC em atm. 5% CO2
 Leitura
+
–
 16 a 18
O teste Positivo é preditivo de resistência à penicilina, ampicilina e amoxacilina
Neisseria gonorrhoeae
 Suspeita de falência terapêutica
 Vigilância
 Estudos para orientar terapia empírica
NCCLS.M100 -S15, 2005
“RESISTÊNCIA INTRÍNSECA”
CEFOXITINA
 C. freundii
 Enterobacter spp
 Serratia spp
Amp/A.clavulânico e Amp/sulbactam
 Citrobacter spp
 Enterobacter spp
 Serratia spp
Man Clin Microb, 7ªedição, 1999
“RESISTÊNCIA INTRÍNSECA”
Enterobacteriaceae
CEFALOTINA








Citrobacter freundii
Enterobacter spp
M. morgani
P. vulgaris
P. penneri
Providencia spp
Serratia spp
Yersinia enterocolitica
Man Clin Microb, 7ªedição, 1999
“RESISTÊNCIA INTRÍNSECA”
Enterobacteriaceae
AMPICILINA









Citrobacter freundii
Enterobacter spp
Klebsiella spp
M. morgani
P. vulgaris
P. penneri
Providencia spp
Serratia spp
Yersinia spp
Man Clin Microb, 7ªedição, 1999
Perfis encontrados nos testes de
sensibilidade que requerem
nova avaliação da amostra.
Microrganismos
Perfil de sensibilidade a ser investigado
Enterobacteriacea
Resistência a carbapenems
E. coli e K. pneumoniae
Resistência às cefalosporinas de 3ª geração
ou monobactans
P.aeruginosa e A.baumannii Resistência à polimixina
S. maltophillia
Sensibilidade aos carbapenems e/ou
resistência ao sulfam/trimetoprim
N. meningitidis
Resistência à penicilina
N. gonorrhoeae
Resistência à ceftriaxona
Man Clin Microb, 7ªedição, 1999
Testes de Sensibilidade a
Antimicrobianos
 A avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos representa
uma das tarefas mais importantes do laboratório de
microbiologia.
 O constante aparecimento de novos mecanismos bacterianos
de resistência e novos antimicrobianos tornam os testes cada
vez mais complexos
 É necessário uma atualização constante dos protocolos e a
freqüente implementação de novos testes e metodologias.
 Microbiologistas, patologistas clínicos e médicos assistentes
são obrigados a estarem em constante atualização
Muito obrigada!
Antonia Maria de Oliveira Machado
[email protected]