Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado Diretora Técnica Instituto Paulista de Doenças Infecciosas e Parasitárias Laboratórios Laboratório Central - HSP - UNIFESP Métodos de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (TSA) Beta Lactâmicos GRUPOS: Anel -lactâmico Penicilina Cefalosporinas Monobactâmicos: O aztreonam Carbapenêmicos: Sítio de ação da -lactamase imipenem meropenem ertapenem Cefalosporinas 1a Geração Cefazolin 2a Geração Cefamandol Cefonicid Cefotetan Cefoxitina Cefuroxima 3a Geração Cefoperazona Cefotaxima Ceftazidima Ceftizoxima Ceftriaxona 4a Geração Cefepima RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS Aeróbios Metronidazol Natural ou intrínseca ou Constitutiva Anaeróbios Adquirida Plasmidial Transmissível Cromossômica Produção: ßlactamases, fosfotransferases, hidrolases, redutases. Resistência múltipla Aminoglicosídeos Mutação de genes Resistência únicanão é transmitida de célula para célula a menos que o gene esteja em integron Evolução Clínica Paciente Imunidade Microrganismo Farmacologia Teste de sensibilidade Antimicrobiano Reprodução da descoberta de Fleming Reprodução da placa de Fleming para a prova de sensibilidade aos antibióticos TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS METODOLOGIAS Avaliação QUALITATIVA DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR Avaliação QUANTITATIVA DILUIÇÃO EM CALDO Macrodiluição Microdiluição DILUIÇÃO EM ÁGAR AUTOMATIZADOS ETEST MACRODILUIÇÃO Método quantitativo MIC g/mL 100 50 25 12.5 6.25 3.12 .16 Conceito Precisão Vantagens Desvantagens .8 .4 controle MACRODILUIÇÃO EM CALDO Determinação do MIC 12.5 6.25 3.12 g/mL MIC É a menor concentração inibitória mínima que inibe completamente o crescimento bacteriano. MACRODILUIÇÃO MIC g/mL 100 MBC 50 25 12.5 6.25 • • • • • • 3.12 .16 .8 •••• ••••• •••• .4 controle MICRODILUIÇÃO TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR Utilizado rotineiramente Fácil execução Flexibilidade na escolha dos antibióticos Reprodutibilidade nos resultados Padronização dos resultados Baixo custo TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR Princípio do método Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Leitura e Interpretação mm DILUIÇÃO EM ÁGAR Utilizado em estudos epidemiológicos Fácil execução Permite testar vários isolados simultaneamente Promove resultados quantitativos Permite o teste de bactérias fastidiosas Baixo custo (relativo) Poucos isolados Preparo das placas e estocagem DILUIÇÃO EM ÁGAR Ágar com 6 g/mL de Vancomicina Enterococcus spp. S 4 g/mL I 8-16 g/mL R 32 g/mL Diluição em Ágar - Desvantagens Muito trabalhoso, tanto a preparação das placas quanto a preparação do inóculo, especialmente quando vários antimicrobianos devem ser testados As placas de ágar não podem ser armazenadas por muito tempo Helio Sader - LEMC Etest Princípio do método Etest®Difusão Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Curva de regressão 100 50 25 MICs (g/mL) 12 6.25 3.12 1.6 0.8 0.4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Diâmetro de zona de inibição (mm) Relação entre o MIC, Zona de inibição e “Breakpoints”. MIC DIFUSÃO 100 50 25 12.5 6.25 3.12 .16 .8 .4 g/mL 30 50 25 12.5 6.25 3.12 18 mm controle Interpretação do Etest Interpretação do Etest Interpretação do Etest NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS CLSI - antigo“NCCLS” Organização internacional, interdisciplinar e educacional que promove o desenvolvimento e a ampla utilização de normas e procedimentos laboratoriais padronizados. A subcomissão do CLSI é composta de representantes de profissões, do governo e indústria, incluindo laboratórios de microbiologia, educadores, farmacêuticos, etc. TESTE DE SENSISIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS Padronização Processos Padronizados (POPs) Controle de qualidade dos itens: meios (efeito timidina ou timina) pH temperatura incubação discos (ATCCs) fitas de Etest Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Bactéria e Preparo do Inóculo Suspensão direta Método de crescimento 0,5 McFarland 1a 2x108 UFC/mL Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Bactéria e Inóculo Bactéria recentemente isolada Colônias bem isoladas CRESCIMENTO BACTERIANO TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR MEIOS 1- Ágar Mueller-Hinton 2- Ágar Mueller-Hinton suplementado 3- Ágar GC 3- Haemophilus Test Medium (HTM) TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR MEIO MUELLER- HINTON Reprodutibilidade do teste. Baixo teor de inibidores de sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclinas. Permite crescimento satisfatório da maioria dos patógenos. Grande número de dados e experiência com o meio. TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR O que devemos saber sobre os meios? Hidratar e autoclavar 60 a 70 mL 150 mm 25 a 30 mL 90 mm pH 7.2 a 7.4 Conservação 2 a 8oC Teste de esterilidade 4 mm TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR O que devemos saber sobre os meios? Umidade Efeito da Timidina ou Timina Inibidores das sulfonamidas e trimetoprim. Conservação 2 a 8oC Teste de esterilidade Efeitos da variação de Magnésio e Cálcio TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR Discos Conservação 8oC ou freezer (não “frost free”) Imipenem, Ertapenem Cefaclor e combinações de ác.clavulânico Retirar do refrigerador ou do freezer até 2 horas antes do uso Evitar umidade Data de validade Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Seleção dos antibióticos Laboratório Clínico Infectologistas Comissão de Infecção Hospitalar Comissão de Controle de Antimicrobianos Farmácia Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Quando e porquê realizar o antibiograma? Isolado requer terapia antimicrobiana Isolado cuja susceptibilidade não é preditiva Isolado capaz de exibir resistência Orientação terapêutica Permite individualizar padrões de resistência Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inóculo Métodos: Crescimento Suspensão direta Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inóculo - Método do crescimento 3 a 5 colônias 4 a 5 mL de TSB Incubar a 35oC - (2 a 6h) Ajustar a turbidez 0,5 McFarland 1a 2x108 UFC/mL Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inóculo - Suspensão direta 3 a 5 colônias Ajustar a turbidez 0,5 McFarland 1 a 2 x 108 UFC/mL Estabilizar 15 min. 4 a 5 mL de TSB ou salina Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inóculo Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inoculação Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inoculação Superfície do ágar não deve estar úmida Inoculação homogênea Esperar diminuir a umidade antes da aplicação dos discos Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Aplicação dos discos Bateria pré determinada Aplicar e pressionar o disco Aplicar no máximo 12 discos na placa de 150mm 5 discos na placa de 90mm Inverter a placa e incubar 15 minutos após a aplicação Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Incubação Temperatura Atmosfera 35oC atm ambiente exceção Haemoplilus spp., N. gonorrhoeae e estreptococos CO2 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Leitura e Interpretação TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS O que testar? Como interpretar? “CLSI-2005 ” A lista de cada microrganismo Quais são os antibióticos devemos utilizar? Grupo A: 1ª escolha - testados e reportados Grupo B: 1ª escolha - testados e reportados seletivamente Grupo C: suplementares e reportados seletivamente comportamento Grupo U: testados em isolados de urina aceitável nas Grupo O: outros não rotineiramente utilizados compreende agentes de eficácia comprovada e que tem um provas in vitro. Grupo inv: em investigação “CLSI” Recomendações na escolha dos antimicrobianos Padronização das técnicas Critérios para a interpretação dos resultados Parâmetros para o controle qualidade do teste. Interpretação do Resultado Susceptível (S) A categoria susceptível implica que a infecção causada pela cepa bacteriana isolada pode ser adequadamente tratada com a dosagem do antimicrobiano recomendada para o tipo de infecção e o agente infeccioso. Desde que não haja contra indicação. Interpretação do Resultado Intermediária (I) A categoria intermediária inclui isolados cujos MICs são próximos aos do sangue e tecidos. Ela permite a aplicabilidade do antimicrobiano em infecções em sítios onde as drogas são fisiologicamente concentradas ou quando doses maiores podem ser utilizadas. Interpretação do Resultado Resistente (R) A categoria resistente inclui isolados que não são inibidos pelas concentrações usuais do antimicrobiano na dosagem padrão e/ou falha quando um específico mecanismo de resistência é expressado. Avaliação da Sensibilidade Streptococcus pneumoniae Mueller-Hinton agar com 5% de sangue de carneiro Inóculo suspensão direta, 0,5 McFarland Incubação 35oC ± 2o em atm. 5% CO2 Leitura 20 a 24h Controle de qualidade S.pneumoniae ATTC* 49619 CLSI, M100-S15, 2005 Avaliação da Sensibilidade Streptococcus pneumoniae Escolha dos discos Tabela 2G Oxacilina Penicilina não recomendado para outros estreptococos Diâmetros de inibição específicos (Tabela 2G) Interpretação Oxacilina 20 mm Sensível 19 mm MIC penicilina, meropenem e ceftriaxona ou cefotaxima CLSI, M100-S15, 2005 Streptococcus pneumoniae CLORANFENICOL 3 ERITROMICINA 1 Azitromicina Claritromicina Ampicilina, Amoxacilina, OFLOXACINA OXACILINA 1g PENICILINA 1 RIFAMPICINA 3 GATIFLOXACINA 3 SULFA/TRIMET 1 VANCOMICINA 2 20mm S Levofloxacina Moxifloxacina < 17 mm 19 mm amoxacilina/ác.clav. ampicilina/sulb., cefaclor, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona, cefuroxima, imipenem e meropenem MIC Penicilina Meropenem Ceftriaxona CLSI, M100-S15, 2005 Avaliação da Sensibilidade Streptococcus spp. Mueller-Hinton agar com 5% de sangue de carneiro Inóculo suspensão direta Incubação 35oC ± 2o em atm. 5% CO2 Leitura 20 a 24h Controle de qualidade S.pneumoniae ATTC* 49619 CLSI, M100-S15, 2005 Avaliação da Sensibilidade - Enterococos Ágar Mueller-Hinton Inóculo crescimento ou suspensão direta Incubação 35oC ± 2o em atm. ambiente Leitura 16 a 18h, 24h para Vancomicina R MIC CLSI, M100-S15, 2005 Enterococcus resistente à Vancomicina (VRE) 1º Isolado final dos anos 80 30 anos após Vancomicina > 20% das infecções pelo Enterococo Enterococcus resistente à Vancomicina (VRE) Resistência Intrínseca Enterococcus gallinarum e E. casseliflavus Resistência adquirida Enterococcus faecium e E. faecalis Detecção do pigmento - Enterococcus spp. BHIA E. faecium E. faecalis E. gallinarum Pigmento amarelo Sim Motilidade 30ºC Positivo Negativo E. mundii E. casseliflavus Avaliação da sensibilidade dos Enterococcus spp. S Imipenem E. faecalis Penicilina S AMPICILINA 1 CIPROFLOXACINA U CLORANFENICOL 3 GENTAMICINA 120 g 3 Amoxicilina, Amoxacilina/ác.clav., ampicilina/sulbactan, piperacilina e piperacilina/tazobactan. STREPTOMICINA 300 g 3 Para cepas não produtoras de lactamases TEICOPLANINA VANCOMICINA 24 h de incubação 2 15-16 mm MIC QUINUPRISTIN/DALFOPRISTIN 2 Detecção de lactamases + R Penicilina Sinergismo positivo Sinergismo negativo 7-9 mm MIC E. faecalis ATTC® 29212 CLSI.M100 -S15, 2005 VRE + – Avaliação da Sensibilidade Estafilococos Ágar Mueller-Hinton Inóculo suspensão direta Incubação 33 a 35oC em atm. ambiente Leitura 16 a 18 24h Oxacilina/Cefoxitina e Vancomicina MRSA e MRS CLSI, S15, 2005 Staphylococcus não aureus Staphylococcus aureus CIPROFLOXACINA CLINDAMICINA ERITROMICINA GENTAMICINA 3 2 2 3 OXACILINA 1g 1 CEFOXITINA PENICILINA 1 SULFA/TRIMET 2 TEICOPLANINA VANCOMICINA 2 Quinupristin/Dalfopristin 3 LINEZOLIDA 3 Gene mec A Levofloxacina Ofloxacina Azitromicina Claritromicina Rotineiramente não são reportado em urina <14mm MIC MRSA CIPROFLOXACINA CLINDAMICINA ERITROMICINA GENTAMICINA 3 2 2 3 OXACILINA 1g 1 CEFOXITINA PENICILINA 1 SULFA/TRIMET 2 TEICOPLANINA VANCOMICINA 2 Quinupristin/Dalfopristin 3 LINEZOLIDA 3 MRS As penicilinas, cefens e outros lactâmicos como amoxi/ác.clav., ampi/sulb., ticarcilina/ác.clav. e carbapenems Oxa s e PS S Oxa s e PR lactamase Oxa R PR CLSI, S15, 2005 NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS “NCCLS”- 2001 Staphylococcus spp. Vancomicina halo 14 mm MIC Incubação por 24horas a 33 a 35°C MIC 4 g Encaminhar a Laboratório de Referência Detecção do VISA e VRSA Diluição em ágar BHIA 6 g/mL Vancomicina Detecção do VISA e VRSA E-test Avaliação da Sensibilidade Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia e Burkholderia cepacia Ágar Mueller-Hinton Inóculo método do crescimento ou suspensão direta Incubação 35oC ± 2o em atm. ambiente Leitura 16 a 18h S. maltophilia e B. cepacia P. aeruginosa na Fibrose cística 20 a 24 horas Controle de qualidade P. aeruginosa ATTC* 27853 E. coli ATTC* 35218 E. coli ATTC* 25922 CLSI.M100 -S15, 2005 Pseudomonas aeruginosa AMICACINA TOBRAMICINA GENTAMICINA CEFEPIMA CEFTAZIDIMA CIPROFLOXACINA IMIPENEM MEROPENEM PIPERACILINA TICARCICINA PIPE/Tazo TICARC/ Ác.clav. POLIMIXINA 2 2 1 2 1 2 2 2 1 1 O O Cefotaxima Levofloxacina Acinetobacter spp. AMICACINA GENTAMICINA AMPICILINA/Subac. CEFEPIMA CEFTAZIDIMA CEFTRIAXONA CIPROFLOXACINA IMIPENEM MEROPENEM PIPERACILINA TICARCICINA PIPE/Tazo TICARC/ Ác.clav. POLIMIXINA Pode ser reportado quando a cepa for resistente 2 1 2 1 3 2 2 2 1 1 O O CLSI,M100 -S15, 2005 Stenotrophomonas maltophilia Burkholderia cepacia LEVOFLOXACINA 2 CEFTAZIDIMA 1 MINOCICLINA 0 MEROPENEM 2 TRIMETOPRIM SULFAMETOXAZOL 3 MINOCICLINA 0 TRIMETOPRIM SULFAMETOXAZOL 3 CLSI.M100 -S15, 2005 Avaliação da Sensibilidade Enterobactérias Ágar Mueller-Hinton Inóculo método de crescimento e suspensão direta Incubação 35oC ± 2o em atm. ambiente Leitura 16 a 18h Controle de qualidade E. coli ATTC* 25922 E. coli ATTC* 35218 NCCLS.M100 -S15, 2005 Enterobactérias AMICACINA 2 AMPICILINA 1 AMPICILINA/Sulbactan 2 AZTREONAM 3 CEFALOTINA 1 CEFEPIMA 2 CEFTAZIDIME 3 CEFOXITINA 2 CEFTRIAXONA 2 CIPROFLOXACINA 2 GENTAMICINA 1 IMIPENEM 2 ERTAPENEM 2 PIPERACILINA/Tazobactan 2 SULFA/TRIMET Amoxacilina Amoxacilina/ác.clavulânico Cefotaxima Levofloxacina Meropenem 2 TICARCILINA/Äc.clavulânico2 CLSI.M100 -S15, 2005 Avaliação da Sensibilidade Haemophilus spp Ágar Haemophilus Test Medium (HTM) Inóculo suspensão direta Incubação 35oC em atm. 5% CO2 Leitura 16 a 18h Controle de qualidade H. influenzae ATTC* 49247 H. influenzae ATTC* 49766 E. coli ATTC* 39218 NCCLS.M100 -S15, 2005 Avaliação da Sensibilidade Haemophilus spp Ágar Haemophilus Test Medium Inóculo suspensão direta Incubação 35oC em atm. 5% CO2 Leitura + – 16 a 18 O teste Positivo é preditivo de resistência à penicilina, ampicilina e amoxacilina Neisseria gonorrhoeae Suspeita de falência terapêutica Vigilância Estudos para orientar terapia empírica NCCLS.M100 -S15, 2005 “RESISTÊNCIA INTRÍNSECA” CEFOXITINA C. freundii Enterobacter spp Serratia spp Amp/A.clavulânico e Amp/sulbactam Citrobacter spp Enterobacter spp Serratia spp Man Clin Microb, 7ªedição, 1999 “RESISTÊNCIA INTRÍNSECA” Enterobacteriaceae CEFALOTINA Citrobacter freundii Enterobacter spp M. morgani P. vulgaris P. penneri Providencia spp Serratia spp Yersinia enterocolitica Man Clin Microb, 7ªedição, 1999 “RESISTÊNCIA INTRÍNSECA” Enterobacteriaceae AMPICILINA Citrobacter freundii Enterobacter spp Klebsiella spp M. morgani P. vulgaris P. penneri Providencia spp Serratia spp Yersinia spp Man Clin Microb, 7ªedição, 1999 Perfis encontrados nos testes de sensibilidade que requerem nova avaliação da amostra. Microrganismos Perfil de sensibilidade a ser investigado Enterobacteriacea Resistência a carbapenems E. coli e K. pneumoniae Resistência às cefalosporinas de 3ª geração ou monobactans P.aeruginosa e A.baumannii Resistência à polimixina S. maltophillia Sensibilidade aos carbapenems e/ou resistência ao sulfam/trimetoprim N. meningitidis Resistência à penicilina N. gonorrhoeae Resistência à ceftriaxona Man Clin Microb, 7ªedição, 1999 Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos A avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos representa uma das tarefas mais importantes do laboratório de microbiologia. O constante aparecimento de novos mecanismos bacterianos de resistência e novos antimicrobianos tornam os testes cada vez mais complexos É necessário uma atualização constante dos protocolos e a freqüente implementação de novos testes e metodologias. Microbiologistas, patologistas clínicos e médicos assistentes são obrigados a estarem em constante atualização Muito obrigada! Antonia Maria de Oliveira Machado [email protected]
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