Identificação Laboratorial de
Leveduras de Importância Médica
Inneke Marie van der Heijden
Laboratório de Bacteriologia (LIM-54)
Instituto de Medicina Tropical II
Hospital das Clínicas - FMUSP
Características gerais
Grupo heterogêneo
Unicelulares
Diversidade

Cor das colônias

Textura
Reprodução
Reprodução das leveduras
Assexuada



Estado anamorfo
Por brotamento ou
gemulação
Formação
blastoconídios e
pseudo-hifas
Reprodução das leveduras
Reprodução sexuada: conjugação

Ascosporadas
Candida guilliermondii (anamorfo)
Pichia guilliermondii (teleomorfo)

Anascosporadas
Candida famata (anamorfo)
Debaryomyces hansenii (teleomorfo)

Balistosporadas
Rhodotorula rubra

Basidiosporadas
Cryptococcus neoformans (anamorfo)
Filobasidiella neoformans (teleomorfo)
Procedimentos laboratoriais
Diagnóstico laboratorial
 Exame direto: levedura ou fungo filamentoso ?
 Cultura: isolamento e identificação
Condições adequadas de incubação
 Meio de cultivo
 Temperatura
 Tempo
Meios mais utilizados na
micologia
Agar Sabouraud com cloranfenicol (leveduras e fungos
filamentosos)
Agar PDA (batata-dextrose) (fungos filamentosos)
Agar Mycobiotic=Mycosel= agar seletivo para fungos
patogênicos (uso restrito=inibe vários fungos sensíveis à
cicloheximida, inclusive leveduras)
Exame direto da amostra
“a fresco” entre lâmina e lamínula
após clarificação com KOH (10 a 20%)
com tinta da China (nanquim)
após coloração:
.esfregaços (Gram, Giemsa e outras)
.cortes histológicos (Mucicarmin de Mayer,
Gomori-Grocott, H.E. e outras)
Exame da cultura:
achados microscópicos
Leveduras com filamentação (hifas)


abundante: Candida spp.
escassa: Candida spp e outras dezenas de
gêneros (p.ex. hifas curtas,curvas=Malassezia spp)
Leveduras sem filamentação

Sem cápsula: Candida spp e outros gêneros

capsuladas: Cryptococcus neoformans
Identificação Laboratorial
Exame direto - Leveduras
Coloração de GRAM
Coloração de Mucicarmin
Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP
Coloração de Gomori-Grocott
Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP
Identificação Laboratorial
Pureza das colônias
 Detecção por exame direto
 Sub-cultivo
 Técnica de esgotamento
 Meios seletivos
Cloranfenicol: inibir bactérias
Cicloheximida: inibir fungos anemófilos
Identificação Laboratorial
Características macroscópicas
Identificação Laboratorial
Características microscópicas
Técnica de esgotamento
Finalidade: obter colônias isoladas
Pureza das colônias
Alternativa: meios cromogênicos
CHROMagar Candida
Sugere espécie conforme
cor da colônia:
Verde = C. albicans
Azul = C. tropicalis
Rosa = C. krusei
Branco = outras espécies
e outros gêneros
Identificação Laboratorial
Métodos clássicos

Análise morfológica

Assimilação de fontes de carbono e nitrogênio

Fermentação de carboidratos

Hidrólise da uréia (teste da urease)
Métodos comerciais
Métodos clássicos de
identificação de leveduras
Análise morfológica



presença de cápsula
produção de tubo germinativo, em geral
leitura às 2h
cultivo em lâmina (micromorfologia,
filamentação e presença de clamidosporos)
Tubo germinativo
Identificação presuntiva e rápida de
Candida albicans
Descrito em 1960
Capacidade de formar filamentos na
presença de soro (1-3 h)

Humano, fetal bovino ou cavalo
Técnica simples
94-97% de positividade para C.
albicans
Sidrim et al., 1999
Fonte: Manual da ANVISA, 2005-Módulo 7
Análise morfológica
Produção de tubo germinativo
1
2
1 - ausência de tubo germinativo
2 - presença de tubo germinativo
Produção de tubo
germinativo
Análise morfológica
Cultivo em lâmina
Fonte: Manual da Anvisa, 2005- Módulo 7
Cultivo em lâmina
Espécies de
Candida spp
Candida albicans
Análise morfológica
Presença de cápsula
Análise morfológica
Presença de cápsula
Métodos clássicos de
identificação de leveduras
Assimilação de fontes de C
Assimilação de nitrogênio
}
AUXANOGRAMA
Fermentação de carboidratos

ZIMOGRAMA
Hidrólise da uréia (teste da urease)
}
AUXANOGRAMA
Presença de oxigênio
Utilização de fontes de:

Carbono (a partir de açúcares)

Nitrogênio (a partir de nitrato)
CQ: cepas ATCC
AUXANOGRAMA
Meio basal sem fonte de carbono

Sólido ou líquido

Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL
Inóculo: escala 1 McFarland (2mL)
Incorporar suspensão de levedura ao meio
Aplicação de discos ou açúcar in natura
Incubação 30oC por 24-48h
AUXANOGRAMA
Meio basal sem fonte de nitrogênio

Sólido

Yeast Carbon Base (YCB)- 20mL
Inóculo: escala 1 McFarland (1mL)
Incorporar suspensão de levedura ao meio
Auxanograma
Aplicação de compostos nitrogenados

Peptona (controle positivo)

Nitrato de potássio
Incubação 30oC por 24-48 h até 7 dias
Resultados: presença de zona de
crescimento (leitura visual)
ZIMOGRAMA
Baixa tensão de oxigênio
Fermentação
Utilização de fontes de Carbono

a partir de açúcares

produção de CO2
Meio líquido ou semi-sólido gelosado
a 0,6%
ZIMOGRAMA
Meio basal (3mL)

Azul de bromotimol (opcional), extrato de levedura,
peptona, etanol 95% e água
Solução de açúcar 6% (1,5mL)
Suspensão levedura: 2 McFarland (0,2mL/tubo)
Leitura após 10-14 dias de incubação a 37oC
Resultados: presença ou ausência de bolhas no tubo de
Durham
Testes adicionais
Teste da urease

Positiva: Cryptococcus neoformans

Negativa: Candida albicans
Resistência à cicloheximida

Resistentes: C. albicans, C. stellatoidea,
C.guilliermondii e C.pseudotropicalis
Cultura positiva
Fluxograma para
Identificação de
Leveduras de
Importância Médica
Exame direto
Bactéria
Levedura
Cultura Pura
Sim
Não
Obter Colônia Pura
por isolamento
Cápsula
+
-
Macromorfologia
Tubo Germinativo
Colônia bege:
Criptococcus sp
Colônia
salmão/laranja:
Rhodothorula sp
-
+
C. albicans
Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua)
Cultivo em lâmina
Provas bioquímicas
Blastoconídios - Urease positiva:

Inositol - : Rhodotorula

Inositol + : Cryptococcus
Presença de artrósporos(=artroconidios)

Urease - : Geotrichum

Urease + : Trichosporon (brotamento +)
Artrósporos
Geotrichum sp.
www.botany.utoronto.ca
www.mycology.adelaide.edu.au
Artrósporos –
Trichosporon sp.
http://www.doctorfungus.org
Trichosporon beigelii
Sidrim et al., 1999
Métodos comerciais de
identificação de leveduras
Chromoagar Candida
API 20C AUX (BioMérieux)
ID 32C (BioMérieux)
Candifast (International Microbio)
Vitek (BioMérieux)
Meios cromogênicos
Cromogênicos: detectam enzimas
através de substratos específicos ou
substratos cromógenos
Permitem detecção de colônias mistas
Rápida identificação de C. albicans
Chromoagar Candida
Colônias:
Verdes = C. albicans
Azul = C. tropicalis
Rosa = C. krusei
Branco = outras espécies
Painel de identificação
API20C AUX system (BioMérieux)
19 testes assimilativos - incubação 30oC - 24, 48
e 72 horas
Leitura por verificação de crescimento - turbidez
Necessidade de correlação com a análise
morfológica
Informa a necessidade de testes adicionais
Método de referência
Acurácia entre 96 e 98% para as espécies
patogênicas mais comuns, sem testes adicionais
API20C AUX system
(BioMérieux)
API20C AUX system
(BioMérieux)
API20C AUX system
(BioMérieux)
ID 32 C STRIPS
(BioMérieux)
29 testes
leitura após 24/48 horas de incubação a 30oC visual ou automatizada
taxas de identificação variam de 94 a 98 %
Ramani et al, 1998


taxa de identificação de 92% para as espécies comuns
de leveduras
85 % para isolados raros
apresenta uma base de dados bastante ampliada
Comparação entre os métodos comerciais
semi-automatizados mais utilizados na
identificação de leveduras
Fonte: Sidrim e Moreira, 1999.
Candifast (International Microbio)
Identificação e teste de sensibilidade
Gêneros: Candida, Trichosporon, Cryptococcus, Rhodotorula e
Saccharomyces
Único inóculo e leitura colorimétrica
Resultados em 24 a 72 horas (37oC)
Identificação

sensibilidade actidione

fermentação de 7 açúcares

hidrólise da uréia
Teste de Sensibilidade

sete antifúngicos: 1 concentração
www.int-microbio.com
Vitek system (BioMérieux)
Sistema automatizado: leitura
turbidimétrica
26 substratos baseado nos métodos
convencionais
Bionúmero - banco de dados do
sistema
Resultado: percentual de
probabilidade de ser a espécie
identificada
Vitek system (BioMérieux)
16 espécies de Candida
6 espécies de Cryptococcus
3 espécies de Rhodotorula
2 espécies de Trichosporon
3 espécies de Geotrichum
2 espécies de Prototheca, Pichia
anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces
cerevisiae e Yarrowia lipolytyca
Vitek system (BioMérieux)
Percentual de probabilidade é baixo = testes adicionais
93 % das leveduras comuns foram identificadas
55 % das leveduras menos comum foram corretamente
identificadas
Falhas na identificação:
 42% de C. krusei
 80 % de C. lambica
 88 % de T. beigelli
 83 % de Cryptococcus (não C.neoformans)
Vitek system (BioMérieux)
Sistema rápido e adequado para identificar os isolados clínicos
comuns
Falhas na identificação de leveduras não usuais (Dooley et al,
1994)
Vitek 2
Vitek 2 ID YST Card
47 testes (29 clássicos e 18 enzimáticos)
leitura fluorescente automatizada
15 horas de incubação
base de dados com 51 espécies
inclui Candida dubliniensis e a atualização
sistemática dos gêneros Rhodotorula e
Trichosporon
taxa de identificação de 96,8%
Comparação entre métodos
comerciais para identificação de
leveduras
Candifast X Vitek

98% de concordância (www.int-microbio.com)
Candifast X API 20C AUX (Gundes et al., 2001)

116 isolados clínicos (C.albicans, C.parapsilosis, C.glabrata e
outras leveduras)

87% de identificações corretas para API 20C

82,7% de identificações corretas para Candifast
Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).
Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).
Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).
Considerações finais
Diversos métodos
Diferentes níveis de sensibilidade, especificidade e
acurácia em cada sistema
Necessidade de estudo morfológico e/ou a
complementação com testes tradicionais
Escolha do(s) método(s)

Realidade de cada laboratório

Freqüência de isolamento

Custo do teste

Eficácia do teste