Outros testes de
sensibilidade a
antifúngicos
Dra. Márcia Melhem
Seção de Micologia
Instituto Adolfo Lutz
Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos
Quando avaliar a resistência a antifúngicos
Isolamento de um fungo
Como realizar os testes
Testes
Problemas ainda existentes no método de referência...
Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5-fc
Interpretação dos resultados de MIC (g/mL)
Sensititre YeastOne
Resultado SDD
Comparação de métodos
Indicações do teste de sensibilidade
Espécies
Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade
Considerações finais
índice
Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos
Difusão a partir de discos
Difusão a partir de fitas
Diluição em agar
Diluição em meio líquido
em tubos = macrodiluição
em placas = microdiluição
Quando avaliar a resistência a antifúngicos?
Infecção ou colonização?
Critérios microbiológicos e clínicos para
indicação do teste de sensibilidade a
antifúngicos
Isolamento de um fungo
Levedura
Fungo
Filamentoso
(bolor)
Microbiota humana
transiente ou
permanente
MEIO AMBIENTE
MICROBIOTA
(pele, mucosas, TR,
TGI, TU)
+ MEIO AMBIENTE
Microbiota
transiente (pele,
mucosas, TR)
+ MEIO AMBIENTE
AGENTE
ETIOLÓGICO
Como realizar os testes?
Colônia pura
Plaqueamento
Cultura mista é
uma causa
comum de erro!
Manutenção
Freezer a -20 80°c
Como realizar os testes? 1.Inóculo
Suspensão
de células
do fungo
Soluçãopadrão=
106 ufc/mL
=
Comparação para
ajuste de turbidez:
espectrofotômetro
ou visual
INÓCULO
Como realizar os testes? 2. Condições
INÓCULO
X
ANTIFÚNGICO (s)
= Sensibilidade
CONDIÇÕES PARA O TESTE: temperatura, tempo e meio de cultura
Meio Sólido
(agar)
Meio Líquido
(caldo)
Método de Difusão por Discos
... técnicas em agar
Vantagens
Parâmetros definidos para Candida e FZ (M44P)
Fácil de realizar
Similaridade com antibiograma
Desvantagens
Falta padronização para outras drogas
Resultado somente em 3 categorias que não indicam
pequenas alterações ou tendência para ®
Não fornece a concentração inibitória mínima (MIC),
apenas correlaciona MIC com diâmetro do halo
Método de difusão por fitas
... técnicas em agar
Vantagens:
Resultado em CIM = MIC
Facilidade de execução
Disponível no comércio
Desvantagens:
Produto importado (custo)
Trailling
Leitura subjetiva
Inóculo variável
Técnicas em agar
Diluição em ágar
Diversas placas, cada uma contendo agar com
diferentes concentrações de um AFG
Inóculo na superfície (fungos de crescimento
lento, dermatófitos, agentes de cromomicose)
Observa-se a inibição do fungo na CIM (Vantagem
sobre técnica de disco)
fungo
64
32
16
8
4
(g/mL)
2
1
0,5
Placa com agar
e afg
Variante do teste em placa:
Teste Rápido para leveduras frente a FZ
Agar com FZ (8g/mL)
Colônias pequenas: sensíveis
Colônias grandes: resistentes
Mas,
requer ainda melhor avaliação com cepas R
Testes em meio líquido
Em tubos = macrodiluição ou macrométodo
Em placas de microtitulação = microdiluição ou micrométodo
Método de Referência para leveduras
(Candida spp e Cryptococcus neoformans)
Doc. M27-A, 2002- NCCLS
Método de Referência para Fungos Filamentosos
(Aspergillus, Fusarium, Rhizopus e Scedosporium)
Doc. M38-P, 2002- NCCLS
Macrométodo
Série de 10 tubos com várias concentrações do
antifúngico + inóculo do fungo
Após 24 a 72 h observa-se os tubos em que houve
inibição de crescimento
Entre esses tubos, o que contém a menor concentração
corresponde ao MIC
Micrométodo em placa
CONCENTRAÇÕES DECRESCENTES DO ANTIFÚNGICO
INÓCULOS
Controle
de
esterilidad
e do meio
Inóculos
cepas ATCC
MIC
Controle de
crescimento
dos inóculos
Micrométodo em placa
Automatização = resultados acurados
Meio RPMI + 2% glicose em tampão MOPS = inerte
Placas de microtitulação, 96 orifícios= economia de reagentes
Placas contendo [FZ] de 0,12 até 64g/mL; [IZ] e[ AB] de 0,015 a 8g/mL=
armazenadas e congeladas, prontas para uso
Leitura da inibição: visual ou espectrofotométrica com valor da d.o.impressa em
fita = rastreabilidade de resultados
Determinação do MIC:
Para azóis = desprezar crescimento residual devido ao trailing  MIC é concentração
que inibe 50% do crescimento, em relação ao controle positivo (coluna 12)
Para AMB: concentração que inibe 100% do crescimento
Micrométodo
em placa
Vantagens: acurácia (procedimento e leitura)
Problemas ainda existentes
no método de referência...
Fenômeno trailing ou arraste
observado para azóis e 5-fc
AB
100%
16 µg/ml 8
4
2
1
0.5
0.25
0,12
0,06
C+
de inibição
(NCCLS)
90%
(EUCAST)
CIM
Azóis
80%
64 µg/ml 32
16
8
4
2
1
0,5
0,25
C+
Inibição
(MACRO)
CIM
50% de
inibição
(MICRO)
E ainda...
Método tem baixa sensibilidade p/ identificar cepas resistentes à
anfotericina B - AMB.
Não é viável para laboratório de análises clínicas (complexidade e
custo). Algumas espécies de leveduras não crescem bem nas
condições de incubação (T , t, meio de cultura?)
Outros métodos denominados NCCLS-like :
Europa: comitê da ESCMID = EUCAST (modificações na
microdiluição: adição de glicose ao meio de cultura, suspensão
mais concentrada do fungo, leitura antecipada, agitação das
placas, etc...).
Interpretação dos resultados de MIC (g/mL)
S
SDD
R
<8
16 - 32
> 64
Afg
FZ
NCCLS 2002
IZ
< 0,25
0,25-0,5
>1
AMB
<2
-
>2
S = sensível;
R = resistente;
SDD = sensibilidade dependente da dose:
100 mg/dia= 6-7 ug/mL de soro
FZ
400 mg/dia= 20 ug/mL de soro
800 mg/mL=50-60 ug/mL de soro
Sensititre YeastOne
•
•
•
Indicador Alamar Blue (oxidação-redução)
2 cepas/placa x IZ, FZ, 5FC
Película selante. Incubação 35°C/24h – 48h
Crescimento:
negativo
inibição parcial ( trailing)
positivo
Resultado SDD
Concentrações séricas de FCZ
Dose diária de FZ (mg/dia)
Concentração sanguínea (g/mL)
100
6
400
20-30
800
40-60
Comparação de métodos
[Ramani & ChatuRverdi JCM 2003;41]
17 laboratórios de Nova York, USA
•
•
5 cepas ATCC
Correlação boa:
• AMB = 85 %
• FZ = 74 %
E-test (3/17)
Microdiluição (14/17)
Maiores erros:
• Apenas 1/17 indicou C.krusei
FZ®
• Nenhum indicou C.lusitaniae
AMB®
Comparação de métodos
235 cepas de Candida glabrata
E-test com azul de metileno
Difusão por discos
FZ = 91-96%
Microdiluição
VZ = 93-95%
Pfaller et al., 2003
726 cepas de Candida sp
E-test
Microdiluição
Caspofungina = alta correlação, exceção C.lusitaniae
Pfaller et al., 2002
Comparação de métodos
102 cepas Candida spp e Saccharomyces cerevisiae
E-test
Microdiluição
Correlação E test x NCCLS VZ = 100%
Correlação E test x NCCLS Caspofungina = 89%
Chryssanthou, E & Cuenca-Estrella JCM 2002;40
Indicações do teste de sensibilidade
Critério microbiológico: depende da
identificação da espécie
Após a identificação da espécie....
1.
Espécie reconhecidamente, resistente
® aos azóis ou anfotericina B
2.
Espécie sensível
Espécies: 3 tipos ®
® INTRÍNSECA: todos os membros são ®
Ex.: fungos filamentosos e levedura Candida
krusei
frente ao fluconazol (FZ)
Há indicação do teste de sensibilidade ao FZ ? não
E para outros azóis? sim
Espécies ®
® NATURAL: alguns membros são ®
Ex.:
Candida glabrata ao FZ
C.lusitaniae, Aspergillus, Rhizopus à anfot.B (AMB)
Há indicação do teste de sensibilidade ? sim
Espécies ®
® ADQUIRIDA: após exposição à droga, alguns membros, ou todos, tornamse ®
Ex.:
C.glabrata,C.albicans,C.parapsilosis, C.tropicalis e outras espécies
a FZ, itraconazol e cetoconazol
Há indicação do teste de sensibilidade ? sim
Candida glabrata
Desenvolve ® de modo muito
rápido, poucas horas de exposição
ao FZ.
Não se recomenda tratar infecções caudadas por C.glabrata com FZ.
Espécies reconhecidamente, sensíveis
Avaliação da sensibilidade in vitro não precisa ser feita de
rotina, para a orientação terapêutica.
A identificação da espécie, em regra, é suficiente para
manter ou re-orientar tratamento.
Critérios clínicos para indicação do teste de
sensibilidade
Paciente com histria de profilaxia com azól.
Caso de falha terapêutica.
Caso com infecção por espécie com perfil de sensibilidade
desconhecido ou pouco estudado.
Considerações finais
1.
Testes em agar podem ser úteis para triagem de
cepas resistentes, desde que, realizadas dentro de
um protocolo rígido, com cepas-padrões e
monitorados por um laboratório de referência
(método NCCLS ou NCCLS-like).
2.
Os métodos de referência não são aplicáveis a todas
as espécies de fungos.
3.
Não existe um método com boa sensibilidade para
identificar cepas AMB ®.
4.
A aplicação clínica de testes de sensibilidade a
antifúngicos é limitada.