UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
PRACTICA N° 1:
Electroforesis y Análisis de Secuencias de ADN
ESTUDIANTE:
Rubiliz Silvana Huancco Bravo
DOCENTE:
Dr. Hebert Hernan Soto Gonzales
CURSO:
Biotecnología
Junio 22 – 2021
Ilo – Perú
UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
INDICE
1.
INTRODUCCION ........................................................................................................... 3
2.
OBJETIVOS................................................................................................................... 4
3.
2.1.
Objetivo General ..................................................................................................... 4
2.2.
Objetivos Específicos.............................................................................................. 4
REVISION LITERARIA .................................................................................................. 5
3.1.
Electroforesis .......................................................................................................... 5
3.2.
Programa SnapGene .............................................................................................. 5
3.3.
Gel de Agarosa ....................................................................................................... 5
3.4.
Secuencia de ADN.................................................................................................. 5
3.5.
Enzimas de Restricción .......................................................................................... 5
4.
METODOLOGIA ............................................................................................................ 6
5.
RESULTADOS............................................................................................................. 12
6.
CONCLUSIONES ........................................................................................................ 13
7.
REFERENCIAS ........................................................................................................... 14
8.
CUESTIONARIO.......................................................................................................... 15
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1. INTRODUCCION
Los “microorganismos” incluye a un grupo variado de organismos, relacionados entre
sí por su tamaño microscópico (ArgenBio, s.f.).
Son utilizados muy abundantemente como agentes productores, tanto de productos
de origen microbiano como de otros orígenes (Santero Santurino, 2008).
Actualmente los científicos pueden seleccionar a los organismos que sean más
eficientes en los procesos implicados en la producción de productos o en la generación de
servicios (Colegio Santo Domingo, s.f.).
El estudio del ADN de los microorganismos ha potenciado la identificación de estos a
partir de diferentes técnicas moleculares, tal es caso de la electroforesis, que es aquella
técnica que tiene como función la separación de moléculas según la movilidad de estas en un
campo eléctrico (QuimiNet, 2012)
Muchas moléculas importantes biológicamente (aminoácidos, péptidos, proteínas,
nucleótidos, ácidos nucleicos…) poseen grupos ionizables y existen en solución como
especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones (Padilla Peña).
La secuenciación del ADN significa determinar el orden de los cuatro componentes
básicos químicos, llamados "bases", que forman la molécula de ADN (National Human
Genome Research Institute, 2019).
No obstante, existen otros métodos electroforéticos por ejemplo como la electroforesis
en campo pulsado, mayormente manipulado para separar fragmentos más grandes de ADN
y la electroforesis bidimensional que brinda un análisis más acertado de las proteínas. (Yabar
Varas, 2003).
Por ende, el presente estudio tiene como base la recopilación de datos del NCBI (Base
de datos de búsqueda de información del Centro Nacional de Biotecnología) y el respectivo
análisis de la secuencia de ADN con la asimilación del gen agarosa realizado en el programa
SnapGene.
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2. OBJETIVOS
2.1.
Objetivo General
 Realizar la electroforesis y el análisis de la secuencia de ADN en el programa
“SnaGene” escogiendo 15 nucleótidos de la página web NCBI.
2.2.
Objetivos Específicos
 Definir los términos en la técnica de electroforesis
 Analizar las secuencias de las 15 bandas de nucleótidos con las enzimas de
restricción
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3. REVISION LITERARIA
3.1.
Electroforesis
Es una técnica para separar el ADN, el ARN, o moléculas o proteínas en base
a su tamaño y carga eléctrica. Se realiza generalmente en una especie de caja que
tiene una carga positiva en un extremo y una carga negativa en el otro (Austin, s.f.).
3.2.
Programa SnapGene
Es una aplicación para manejo de procedimientos de biología molecular.
Presenta herramientas útiles para análisis de secuencia de ADN y admite una
variedad de formatos de archivo comunes (AbrirArchivos, s.f.).
3.3.
Gel de Agarosa
Es un polisacárido natural provenientes de las algas. Su función es la
separación de cadenas en tamaños pequeños hasta un rango de kb ( kilobases). El
gel suele correrse de manera horizontal y. con buffer de manera TBE (Tris, Borato,
EDTA) y TAE (Tris, Ácido Acético, EDTA) (Ortiz Casas, 2018).
3.4.
Secuencia de ADN
La secuenciación del ADN significa determinar el orden de los cuatro
componentes básicos químicos, llamados "bases", que forman la molécula de ADN.
Además, y de manera muy importante, los datos de las secuencias pueden
resaltar los cambios en un gen que pueden causar enfermedades (National Human
Genome Research Institute, 2019).
3.5.
Enzimas de Restricción
Se utilizan para reconocer secuencias de genes específicas y luego reinsertar
fragmentos en el genoma de otro organismo, usando un vector apropiado, para que
así se aproveche las propiedades de especificidad y la producción de extremos
cohesivos por algunas enzimas de restricción (Watson y otros., 1992)
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4. METODOLOGIA
1. Entrar a la página de NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, y colocar nucleotide en la
primer box y luego poner 16s en la segunda.
2. Por defecto saldrá ejemplos para seleccionar, en este caso solo se tomara 15 secuencias.
3. Como ejemplo: Neisseria gonorrhoeae 16S rRNA, se consideró al primero debido a la
cantidad mayor de pares de bases (bp), entre todos los resultados.
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4. Se selecciona FASTA y se copia la secuencia de lo cual se traslada a un block de
notas que se guarda con el nombre del nucleótido como referencia para la simulación
con el gel de agarosa en el programa SnapGene.
5. En el programa SnapGene añadimos las 15 muestras.
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6. Para dar a conocer las enzimas de restricción se cambió en la parte inferior del formato
mapa al formato secuencia y se tuvo que encontrar cuales eran, por ejemplo:
7. Resultando en la separación debido al movimiento del ADN por la simulación que en
laboratorio se origina por que el ADN al ser una carga negativa al entrar en contacto
con el líquido fluorescente de la alícuota este buscara al polo positivo.
8. Historial de todas las separaciones de al menos 2 enzimas de restricción para cada
secuencia.
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5. RESULTADOS
En el grafico se muestra el comportamiento de los diferentes nucleótidos en la
electroforesis con la simulación del gel agarosa en el programa “SNAPGENE”.
En el grafico se muestra todas las secuencias de genes específicas de al menos 2
enzimas de restricción para cada secuencia.
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6. CONCLUSIONES
En el programa SnapGene fue fácil de manipular con las respectivas indicaciones, en
el cual el total de muestras escogidas permitió dar a conocer el grafico de las bandas sin
ningún inconveniente, la asimilación de gel agarosa permitió la separación de cadenas en
tamaños pequeños en el grafico en unidad de kb, también se pudo reconocer las secuencias
de genes específicas con las enzimas de restricción identificadas en el proceso final.
Conocer los términos para esta práctica fue crucial para entablar los objetivos, el
procedimiento y por ende las conclusiones finales de la práctica de electroforesis.
Las 15 secuencias proporcionaban un buen número de ER (enzimas de restricción),
por el cual solo se escogió dos como mínimo para demostrar la calidad.
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7. REFERENCIAS
AbrirArchivos.
(s.f.).
GSL
Biotech
SnapGene.
Obtenido
de
https://abrirarchivos.info/software/gsl_biotech/snapgene
ArgenBio.
(s.f.).
Obtenido
de
MICROBIOS
ÚTILES
PARA
LA
INDUSTRIA:
https://www.argenbio.org/biotecnologia/150-3-aplicaciones-de-la-biotecnologia
Austin, C. P. (s.f.). Electroforesis. Obtenido de https://www.genome.gov/es/geneticsglossary/Electroforesis
Colegio Santo Domingo. (s.f.). Obtenido de Microorganismos en la Biotecnología:
https://www.colegiosantodomingo.cl/wpcontent/uploads/2018/11/15_Microorganismos-en-la-Biotecnolog%C3%ADa.pdf
National Human Genome Research Institute. (27 de Septiembre de 2019). Obtenido de
Secuenciación
del
ADN:
https://www.genome.gov/es/about-genomics/fact-
sheets/Secuenciacion-del-ADN
Ortiz Casas, B. (24 de Agosto de 2018). Electroforesis de ADN: Conceptos Básicos. Obtenido
de https://www.youtube.com/watch?v=KGZBRfHQU_Y
Padilla Peña, C. A. (s.f.). Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento
y
caracterización
electroforética
de
DNA
plasmídico.
Obtenido
de
https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES%20AGA
ROSA.pdf
QuimiNet. (15 de Noviembre de 2012). Obtenido de La electroforesis y sus aplicaciones en la
biotecnología:
https://www.quiminet.com/articulos/la-electroforesis-y-sus-
aplicaciones-en-la-biotecnologia-3005538.htm
Santero
Santurino,
E.
(2008).
BIOTECNOLOGÍA
MICROBIANA.
Obtenido
de
https://www.upo.es/export/portal/com/bin/portal/fcex/alumnos/GuiasDocentes/LicBiot/
1364811746468_626_biotecnologxa_microbiana_08-09.pdf
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8. CUESTIONARIO
 ¿Qué es un gel de agarosa y cómo influye la concentración en la migración de los
fragmentos de ADN?
Es un polisacárido natural provenientes de las algas. Su función es la
separación de cadenas en tamaños pequeños hasta un rango de kb (kilobases). El
gel suele correrse de manera horizontal y. con buffer de manera TBE (Tris, Borato,
EDTA) y TAE (Tris, Ácido Acético, EDTA). Para la migración de los fragmentos de
ADN, se separa por tamaño en un gel de agarosa en un patrón tal que la distancia
recorrida es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular, ya que es
sabido que el ADN tiene una uniforme relación masa / carga.
 ¿Dibuje a mano el proceso de la PCR?
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 ¿Dibuje a mano el proceso de la electroforesis?
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 ¿En el primer video mostrado por el profesor por que las muestras de ADN son
mescladas con un colorante azul? ¿Cómo se llama?
Son mescladas para poder cargar y visualizar las muestras en el gel, su
nombre es Bromuro de etidio.
¿Qué es el bromuro de etídio (BrEt), como lo podemos remplazar, existe otros
colorantes?
El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante pero también es un
colorante fluorescente que se usa en técnicas de biología molecular como la
electroforesis.
Se puede reemplazar con otros colorantes como: GelRed™ y GelGreen™.
 ¿Por qué se utilizaron dos marcadores de peso molecular?
Para el estudio y análisis de las poblaciones de organismos o microrganismos
que tiene como consecuente su respectiva selección a aquellos que presentan rasgos
de interés para la investigación, no obstante, puede ocurrir situaciones en que se
seleccionen antes que expresen el rango de interés.
¿Cuál es tamaño molecular de cada gen obtenido por usted, en caso que se sea de
diferentes tamaños como justifica?
Se compara la migración de las bandas de las muestras con las bandas del
marcador del peso molecular en caso de un procedimiento en laboratorio.
En caso de realizarlo en un programa como el SNAPGENE entonces se acciona un
click en una de las bandas de la gráfica en el cual nos indicara los pares de bases que
que se tiene, y los números que salen a la izquierda de los datos de las bandas
corresponderán al peso molecular en unidad de kilobases. El tamaño se justifica por
la secuencia escogida, es decir que si elijo un rango mayor 1500pb de otro menor
entonces se posicionara en primera fila por su peso molecular más alto.
 ¿Tipos de electroforesis y cómo funciona en gel de agarosa para segmentos de ADN?
Pueden ser: electroforesis de frente móvil o libre, electroforesis de
zona(convencional), electroforesis capilar, electroforesis de ADN, zimografía o
zimogramas, extracción en gel y la electroforesis en gel de campo pulsado.
Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas
cargadas en función de su tamaño y forma.
 ¿Es posible recuperar un fragmento de ADN del gel de agarosa para clonar en un
plásmido y mantener en un organismo? Fundamente.
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Es posible con la técnica de la electroforesis y la recuperación sobre un papel
de DEAE-celulosa. Esta simple técnica se puede aplicar a varias muestras
simultáneamente, teniendo como resultado el ADN de manera altamente pura.
 ¿Qué son las enzimas de restricción, mencione 10?
Son de origen bacteriano que presentan actividad endonucleasa y cortan los
enlaces fosfodiéster del ADN en una secuencia específica denominada secuencia
diana.
Entre las cuales se encuentran: EcoRI, EcoRII, HindII, BamHl HaeIII, Hpall,
Pstl, Mayi, Baml y BgIII.