UNIVERSIDAD NACIONAL
DE MOQUEGUA
FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL
TEMA:
“ELECTROFORESIS Y ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE ADN”
DOCENTE:
BLGO. HEBERT HERNAN SOTO GONZALES
CURSO:
BIOTECNOLOGÍA
ESTUDIANTE:
LIDIA MARLENI COAQUERA ZANGA
CODIGO:
2018205015
CICLO:
VII
CORREO:
[email protected]
FECHA DE ENTREGA:
22/062021
CONTENIDO
1
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 3
2
OBJETIVOS ........................................................................................................................ 4
3
2.1
Objetivo general:......................................................................................................... 4
2.2
Objetivos específicos: ................................................................................................ 4
REVISIÓN LITERARIA ...................................................................................................... 5
3.1
Electroforesis: ............................................................................................................. 5
3.2
Análisis de secuencias de ADN: .............................................................................. 5
3.2.1
Alineación de secuencias de ADN:.................................................................. 6
3.2.2
Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI):...................... 6
4
PROCEDIMIENTO ............................................................................................................. 7
5
RESULTADOS .................................................................................................................. 11
6
CONCLUSIONES ............................................................................................................. 12
7
CUESTIONARIO .............................................................................................................. 13
8
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 18
1
INTRODUCCIÓN
Los microrganismos son un grupo de seres vivos que se encuentran en una gran
variedad de lugares como lo son las plantas, animales y humanos en donde coexisten
con el huésped ayudando a realizar un sin fin de funciones. El estudio del ADN de los
microorganismos ha potenciado la identificación de estos a partir de diferentes técnicas
moleculares, tal es caso de la electroforesis, una técnica que permite el procesamiento
de los fragmentos de ADN que, al ser regiones muy conservadas dentro de cada
especie, es posible identificar a estos. (Montalvo Navarro & Lugo Flores, 2016)
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del
análisis de los ácidos nucleicos y proteínas. Y así como el microscopio permite visualizar
microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a observar los
ácidos nucleicos y proteínas al final del procedimiento. El principio básico de la
electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de
matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán
separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la
separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las
moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la
visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán
posteriormente analizadas e interpretadas. (Yabar Varas, 2003).
En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren
el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de
acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical,
se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros métodos
electroforéticos que presentan ciertas modificaciones, así tenemos la electroforesis en
campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos muy grandes de ADN
(ADN genómico), la electroforesis bidimensional para un análisis más sofisticado de las
proteínas etc. (Yabar Varas, 2003).
El presente estudio se basa en la recopilación de datos del NCBI (Base de datos
de búsqueda de información del Centro Nacional de Biotecnología), para la recolección
de la secuencia de su ADN, para después obtener el fundamento de la técnica de
electroforesis, usando el programa Snap_Gene.
2
2.1
OBJETIVOS
Objetivo general:
o
Determinar la electroforesis y el análisis de secuencia ADN en el programa
Snap_Gene Con 15 nucleótidos obtenido por el sitio web NCBI.
2.2
Objetivos específicos:
o
Análisis del uso del NCBI.
o
Observar la variación de las bandas y a que se debe.
o
Analizar los conceptos básicos como el uso de los programas de simulación.
o
Definir la electroforesis y términos utilizados en la practica.
o
Analizar las secuencias de las 15 bandas de nucleótidos con las enzimas de
restricción.
3
3.1
REVISIÓN LITERARIA
Electroforesis:
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la
movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual
finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la
técnica que se use. (Morales Becerril). La técnica clásica utiliza una tira recubierta de
una sustancia porosa impregnada de un electrolito. Sus extremos se sumergen en dos
depósitos independientes que contienen ambos al electrolito y están unidos a los
electrodos del generador de corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeño
trazo transversal en la tira. La distancia de migración se mide en relación un marcador
interno. Las placas son reveladas con sales de plata, azul de Coomassie, o reactivos en
particular. (Morales Becerril).
Figura 1: Electroforesis
Fuente: (Morales Becerril).
3.2
Análisis de secuencias de ADN:
El análisis de la secuencia de ADN, es el descubrimiento de similitudes
funcionales y estructurales, y las diferencias entre múltiples secuencias biológicas. Esto
puede hacerse comparando las nuevas (desconocidas) con las bien-estudiadas y
anotadas (conocidas) secuencias. Este análisis incluye la alineación de secuencias, la
búsqueda en la base de datos de secuencias, el descubrimiento de patrones, la
reconstrucción de las relaciones evolutivas, y la formación y la comparación del genoma.
Los científicos han encontrado que dos secuencias similares poseen el mismo papel
funcional. La comparación se puede hacer desde aspectos de comportamiento
bioquímico o de acuerdo a la estructura de la proteína. Si hay dos secuencias de
diferentes organismos son similares, se dice que son secuencias homólogas. (Meneses
Escobar, Rozo Murillo, & Franco Soto, 2011).
3.2.1
Alineación de secuencias de ADN:
La comparación de la secuencia de ADN está centro del análisis
bioinformático. Se trata de un importante primer paso hacia el análisis
estructural y funcional de las secuencias recientemente determinadas. El
proceso más fundamental en este tipo de comparación es la alineación
de secuencias. Este es el proceso por el cual, se comparan las
secuencias mediante la búsqueda de patrones de caracteres comunes y
el establecimiento de los residuos de correspondencia entre las
secuencias relacionadas. El alineamiento de pares de secuencias es
fundamental en la búsqueda de similitudes dentro de la base de datos y
el alineamiento de secuencias múltiples. Un concepto importante en el
análisis de la secuencia es una homología de secuencia. Cuando dos
secuencias son descendientes de un origen evolutivo común, se dice que
tienen una relación homóloga u homología. (Meneses Escobar, Rozo
Murillo, & Franco Soto, 2011).
3.2.2
Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI):
El Centro Nacional para la Información Biotecnológica es parte de
la Biblioteca Nacional de Medicina de Estados Unidos, una rama de los
Institutos Nacionales de Salud. Almacena y constantemente actualiza la
información referente a secuencias genómicas en GenBank, un índice de
artículos científicos referentes a biomedicina, biotecnología, bioquímica,
genética y genómica en PubMed, una recopilación de enfermedades
genéticas humanas en OMIM, además de otros datos biotecnológicos de
relevancia en diversas bases de datos. Todas las bases de datos del
NCBI están disponibles en línea de manera gratuita, y son accesibles
usando el buscador Entrez. El NCBI ofrece además algunas
herramientas bioinformáticas para el análisis de secuencias de ADN,
ARN y proteínas, siendo BLAST una de las más usadas. (Wikipedia,
2021).
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PROCEDIMIENTO
Entrar a la página del NCBI (Base de datos de búsqueda de información del
Centro Nacional de Biotecnología), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ , de esta manera
debemos colocar en nucleótido y buscar 16s.
Al realizar esa búsqueda nos mostrara un montón de sugerencia, de las cuales
seleccionaremos cualquiera de ellas:
De los cuales realizamos la selección de 15 especies, primero se procedió a dar
clic en fasta, donde nos muestra la secuencia, después de ello copeamos toda la
secuencia en un blog de notas.
De esta manera realizamos todo, logrando almacenar 15 blog de notas de
distintas especies y géneros, todo ello con la información de la secuencia.
Los cuáles serán insertados en la SNAP-GEN, en el cual daremos desplegamos
en tools, y seleccionamos simulación del gel agarosa.
Después de ello insertamos las 15 especies, como se observa en la imagen, esto
nos indica el comportamiento de los 15 nucleótidos.
En el lado derecho observaremos los gráficos, hay grafica circular, o lineal, por
ejemplo, esta es de la especie Aeromonas hydrophila.
Después agregamos 1 tubo vacío y también un MW Maker (gel simulado para
que se pueda interpolar fácilmente cualquier ADN, para poder comparar con los demás
tubos.
Para dar a conocer las enzimas de restricción se cambió en la parte inferior del
formato mapa al formato-secuencia y se realizó cortes, por ejemplo, Aeromonas
hydrophila. Se realizó 2 cortes basándonos en PspFi, las cuales se del total de 2488
pb, separándose en dos partes la primera de 1716 bp y segundo 772 pb.
Desplazamiento se agrega el líquido para ver cuanto a recorrido
5
RESULTADOS
En el grafico se muestra el comportamiento de los diferentes nucleótidos en la
electroforesis con la simulación del gel agarosa en el programa “SNAPGENE”. En el
grafico se muestra todas las separaciones de al menos 2 enzimas de restricción para
cada secuencia.
Conforme corre el gel, los fragmentos más cortos de ADN viajarán más rápido a
través de los poros de la matriz del gel que los fragmentos más grandes. Después de
un rato que ha corrido el gel, los fragmentos más cortos de ADN estarán más cerca del
extremo positivo del gel y los más largos se mantendrán cerca de los pozos. Los
fragmentos de ADN muy pequeños podrían correr hasta salirse del gel si lo dejáramos
corriendo por demasiado tiempo (¡algo de lo que definitivamente he sido culpable!). Una
vez que los fragmentos se han separado, podemos examinar el gel y saber el tamaño
de las bandas que se encuentran en él. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se
une al ADN y se coloca bajo luz UV, los fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos permite
ver el ADN presente en distintos lugares a lo largo del gel. (LabXchange, 2021).
6
CONCLUSIONES
La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN
según su tamaño. Además, las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras) en un
extremo de un gel y se aplica una corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel.
Los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo
positivo. Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga
por masa, los fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes así
mismo los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo
positivo. Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga
por masa, los fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes.
Atreves del uso del programa se pudo visualizar y realizar cada uno de los
objetivos planteados, donde se observó la separación de fragmento de ADN según su
tamaño, cada uno de las 15 muestras analizadas.
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CUESTIONARIO
1. ¿Qué es un gel de agarosa y cómo influye la concentración en la migración
de los fragmentos de ADN?
Es un polisacárido natural provenientes de las algas. Su función es la
separación de cadenas en tamaños pequeños hasta un rango de kb (kilobases).
El gel suele correrse de manera horizontal y. con buffer de manera TBE (Tris,
Borato, EDTA) y TAE (Tris, Ácido Acético, EDTA). Para la migración de los
fragmentos de ADN, se separa por tamaño en un gel de agarosa en un patrón
tal que la distancia recorrida es inversamente proporcional al logaritmo de su
peso molecular, ya que es sabido que el ADN tiene una uniforme relación masa
/ carga.
2. ¿Dibuje a mano el proceso de la PCR?
3. ¿Dibuje a mano el proceso de la electroforesis?
4. ¿En el primer video mostrado por el profesor por que las muestras de ADN
son mescladas con un colorante azul? ¿Cómo se llama?
El buffer de carga (azul), cargar y visualizar las muestras en el gel, para
poder interpretar cargar un marcado de peso molecular, glicerol presente en la
muestra de carga, bromuro etidio. El buffer de carga (azul) contiene colorante
que sirve para visualizar la migración de DNA durante el proceso de
electroforesis.
5. ¿Qué es el bromuro de etídio (BrEt), como lo podemos remplazar, existe
otros colorantes?
El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante (se intercala entre
las bases nitrogenadas) que se usa como colorante fluorescente para la
visualización de ácidos nucleicos en geles de agarosa y poliacrilamida.
Lo podemos remplazar por GelRed™ y GelGreen™ son tintes
fluorescentes ultra sensibles para ácido nucleico, extremadamente estables y
ambientalmente seguros; diseñados para reemplazar el altamente tóxico
bromuro de etidio (EtBr) para teñir dsDNA (DNA bicatenario), ssDNA (DNA
monocatenario) o RNA en geles de agarosa o geles de poliacrilamida. Si existen
otros colorantes que pueden remplazar al bromuro de etidio.
6.
¿Por qué se utilizaron dos marcadores de peso molecular?
Un marcador es un carácter o un gen que debido al ligamiento puede usarse
para indicar la presencia de otro gen; es decir, cualquier característica A (sea un
gen, una proteína, tipo de hoja, etc.) que esté asociada a la presencia o
expresión de una característica B (como vigor, altura, resistencia a
enfermedades, etc.) puede considerarse como un marcador, pues la presencia
de A necesariamente implica la de B.
La importancia de los marcadores radica en que ofrecen la posibilidad de
estudiar poblaciones de organismos y seleccionar aquellos que presentan
rasgos de interés para el hombre.
7. ¿Cuál es tamaño molecular de cada gen obtenido por usted, en caso que
se sea de diferentes tamaños como justifica?
En el caso del peso molecular ya está determinado en el cuadro que nos
presenta el resultado, por ejemplo si nosotros colocamos el click en una de las
bandas ahí nos indica los pares de bast que tiene cada una, y los números que
salen a la izquierda de los datos de las bandas serian el peso molecular pero en
KB, los tamaños se justifica por las secuencias escogidas, es decir a mayor
secuencia como 4000 pb y otro de 1500 pb, el peso molecular de la de 4000pb
se colocaría primera en nuestros resultados, indicando su peso molecular mas
alto.
8. ¿Tipos de electroforesis y cómo funciona en gel de agarosa para
segmentos de ADN?
Tipos: La electroforesis en gel se utiliza en biología molecular, genética y
bioquímica:
1.
Electroforesis de frente móvil o libre
2.
Electroforesis de zona: (convencional)
o
En papel
o
En acetato de celulosa
o
En gel (agarosa, poliacrilamida y almidón)
3. Electroforesis capilar
4. Electroforesis de ADN.
5. Zimografía o zimogramas
6. Extracción en gel.
7. Electroforesis en gel de campo pulsado
La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para
analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles
se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas
cargadas en función de su tamaño y forma.
9. ¿Es posible recuperar un fragmento de ADN del gel de agarosa para clonar
en un plásmido y mantener en un organismo? Fundamente.
Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular muy comunes
en bacterias que se replican de modo autónomo e independiente del cromosoma
de la célula.
La frecuente necesidad de recuperar y purificar fragmentos de ADN
separados sobre geles de agarosa y poliacrilamida ha llevado al desarrollo de
gran variedad de métodos (1 -9). Teniendo en cuenta que ninguno ha mostrado
ser plenamente satisfactorio, se han realizado modificaciones a cada uno de
ellos con el fin de hacerlos más eficientes. Uno de los métodos utilizados es la
electroforesis y recuperación sobre un papel de DEAE-ce lulosa. Es una técnica
simple que se puede aplicar a varias muestras simultáneamente. El ADN
obtenido es de alta pureza.
10. ¿Qué son las enzimas de restricción, mencione 10?
Las enzimas de restricción son aquellas que presentan actividad endonucleasa,
son de origen bacteriano y cortan los enlaces fosfodiéster del ADN en una
secuencia específica denominada secuencia diana.
Enzimas de restricción y los organismos de donde se extrae:

EcoRI (Escherichia coli)

EcoRII (Escherichia coli)

HindII (Haemophilus influenzae)

HindII (Haemophilus influenzae)

Haelll (Haemophilus aegyptius)

Hpall (Haemophilus aegyptius)

Pstl (Providencia stuartii)

Mayi (Serratia marcesens)

Baml (Bacillus amyloliquefaciens)

BgIII (Bacillus globiggi)
8
BIBLIOGRAFÍA
LabXchange. (2021). Electroforesis en gel. Recuperado el 22 de junio de 2021, de
https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-andregulation/biotechnology/a/gel-electrophoresis
Meneses Escobar, C. A., Rozo Murillo, L. V., & Franco Soto, J. (Diciembre de 2011).
Tecnologías bioinformáticas para el análisis de secuencias de ADN. Universidad
Tecnológica de Pereira, 16(49), 116-121. Recuperado el 21 de Junio de 2021
Montalvo Navarro , C. A., & Lugo Flores, M. A. (30 de noviembre de 2016).
Electrophoresis:
fundamentals,
advances
and
applications.
Universidad
autónoma de baja california, 1-7. Recuperado el 21 de junio de 2021
Morales Becerril, I. (s.f.). electroforesis. Recuperado el 21 de junio de 2021, de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Exposicion_electroforesis_5087.pdf
Wikipedia. (19 de abril de 2021). Centro Nacional para la Información Biotecnológica.
Recuperado
el
21
de
junio
de
2021,
de
https://es.wikipedia.org/wiki/Centro_Nacional_para_la_Informaci%C3%B3n_Bio
tecnol%C3%B3gica
Yabar Varas, C. (2003). Manual de Procedimientos de Electroforesis para proteinas y
ADN. Lima: Instituto Nacional de Salud. Recuperado el 21 de junio de 2021, de
https://bvs.ins.gob.pe/insprint/SALUD_PUBLICA/NOR_TEC/38.pdf