Purificação e caracterização
do anticorpo anti-DRG11
Alunas:
•Cristina Pinto
•Diana Trigo
Sistema Nociceptivo
percepção do estímulo
Somatosensory
Cortex
Injury
Lateral
Thalamus
condução do estímulo
Peripheral
Nerve
Dorsal
Root
Ganglion
processamento
da resposta
Dorsal
Horn
DRG11: papel na nocicepção
• Identificação do local de
expressão da proteína
DRG11 por hibridação com
RNAm
• Observação do fenótipo
de ratinhos knockout
[Chen et al, 2001]
Gentilmente cedido pela Prof.
Sandra Rebelo
Importância da
proteína DRG11 no
desenvolvimento do
sistema nociceptivo
DRG11, factor de transcrição com 30
kDa da família das proteínas homeodomain
103
1
Homeodomain
DNA binding
Proteína Recombinante (46kDa)
GST
Glutationa S-transferase
Anti-drg11
263
OAR
Interacção Proteína-proteína
Anti-drg11
OAR
Interacção Proteína-proteína
•Obtenção dos anticorpos anti DRG11
Proteína de fusão
GST-DRG11 (Cterminal)
Soro
Purificação e caracterização do
anticorpo:
Purificação dos
anticorpos por
Cromatografia
de Afinidade
Doseamento
de IgG antiDRG11
Soro
Imunoblotting
Imunofluorescência
Cromatografia de Afinidade
Lavagens da resina de
sefarose + GST-DRG11
Incubação da resina
com soro “overnight”
Separação do sobrenadante
Montagem da Coluna
Cromatografia de Afinidade
Eluição por adição de solução
de Glicina a pH 2,3
Recolha de 10 amostras
com bomba peristáltica
Neutralização com Tris
a pH 8,5
Doseamento Proteico:
Método de Bradford
• Princípio: o reagente de Bradford
(corante de azul de Coomassie em àcido
fosfórico) liga-se covalentemente às
proteínas , numa reacção acompanhada
de alteração da cor do reagente em meio
ácido. [Bradford MM (1976)]
Doseamento Proteico:
•
Determinação da recta padrão:
–
Prepararam-se 5 amostras com diferentes
concentrações de “bovine serum albumin”(BSA)
e reagente de Bradford
–
Mediram-se as respectivas absorvâncias num
espectrofotómetro a 595nm
Gráfico 1
–
Traçou-se a curva
de calibração
Quantidade BSA
(ug)
Recta Padrão
y = 33,895x - 14,067
25
20
15
10
5
0
R2 = 0,9846
0
0,2
0,4
0,6
Absorvância
0,8
1
1,2
Doseamento Proteico:
imunopurificação anti-drg11
– cada amostra do
anticorpo purificado
– água
– reagente de Bradford
• Medir as absorvâncias
• Determinar as
concentrações das
amostras a partir da
equação da recta
padrão
1000
Quantidade (ug)
• Preparar 10
eppendorfs com:
800
600
400
200
0
0
2
4
6
8
10
12
fracções
Gráfico 2
Western Blotting:
Montagem da cassete (sistema vertical)
Colocou-se 5µg de proteína de fusão
em cada um dos poços
Electroforese
Montagem da cassete de blotting
Transferência das proteínas para a membrana de
nitrocelulose
Revelação com Ponceau S
Cortou-se a membrana às tiras (1 tira para cada fracção)
kDa
97
56
45
36
Imunoblotting
Bloqueio em solução de leite em pó
Incubação com o anticorpo primário
(anti-DRG11 de cada fracção )
Incubação com o anticorpo secundário
conjugado com Fosfátase Alcalina (AP)
Revelação com NBT + BCIP
(substratos da AP)
Imunoblotting
1
imunopurificação anti-drg11
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Quantidade (ug)
1000
800
600
400
200
0
0
2
4
6
8
10
12
fracções
Conclusão:
Gráfico 2
•Verificou-se a ligação do anticorpo à proteína de
fusão através do aparecimento de um precipitado de
cor azul, produto da actividade da AP.
•Nas fracções que possuíam uma maior quantidade de
anticorpo verificou-se um sinal mais intenso.
• Conclusão:
O anticorpo encontrava-se funcional, apesar de
ter sido sujeito a condições agressivas
aquando da sua purificação.
• O anticorpo revelou-se funcional para
proteínas desnaturadas, contudo havia
necessidade de testar a sua actividade em
relação a proteínas nativas in loco.
Imunofluorescência
Imunofluorescência
• Usaram-se cortes transversais da região do
fígado de embriões de ratinhos com 18dias
normais e “knockout”.
• Procedimento:
– bloqueio com soro de cabra;
– incubação com anti-DRG11 (1/200) da fracção 3;
– incubação com anticorpo secundário (anti-rabbit)
conjugado com fluorocromo vermelho (Alexa 594);
– observação dos locais de expressão da proteína
usando microscopia confocal;
Imunofluorescência
• A proteína apresentou como locais de
expressão o corno dorsal da medula
espinhal e gânglios raquidianos,
estruturas envolvidas no processamento
de estímulos nóxicos.
+/+
-/-
• Concluiu-se que os anticorpos estavam
funcionais para futuros trabalhos de
investigação.
NOTA: Os anticorpos já foram utilizados em
experiências realizadas pelo orientador.
Bibliografia:
• Alberts B. et al., Molecular Biology of the Cell, 4th
edition, Garland Science
• Bradford MM (1976).Anal Biochem. 72: 248-54.
• Chen et al (2001).Neuron.31:59-53
• http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein.h
tml
• http://www.mpibpc.gwdg.dc/abtcilungcn/140/confocal
/main.html
• http://www.roche.appliedscience.com
• www.bioscience.com
• www4.amerishambioscience.com
Agradecimentos:
• Prof Doutor Carlos Reguenga
• Serviço de Histologia e Embriologia de
Abel Salazar
• Drª. Sandra Rebelo