Aula 03
Imunologia
ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS – ELISA
O método imunoenzimático para detecção e
quantificação de antígenos ou anticorpos
específicos. Estes grupos observaram que
proteínas poderiam ser imobilizadas em uma
superfície sólida depoliestireno e a reação imune,
ser revelada pela formação de produtos coloridos
da reação enzima-substrato, na presença de um
componente doador de elétrons, denominado
cromógeno.
O ELISA direto é mais usado em imuno-histoquímica. Seu
fundamento consiste na utilização de anticorpos primários
marcados com enzima, que se combinam especificamente aos
antígenos presentes em cortes histológicos. A aplicação da
solução reveladora destaca o material pesquisado.
O ELISA indireto é empregado para a pesquisa de
anticorpos, onde amostras de soro ou plasma são colocadas
para reagir com antígenos imobilizados em uma fase sólida
(placas de ELISA). Posteriormente, são revelados com auxílio de
conjugado enzimático específico levando a formação de um
produto corado ao agir sobre substratos cromogênicos. Para
pesquisa de antígenos presentes em material biológico, a
amostra é posta para reagir com anticorpos específicos
imobilizados na fase sólida.
O ELISA competitivo consiste na pesquisa de antígeno,
onde o anticorpo é mobilizado na fase sólida e o antígeno
correspondente compete com uma quantidade padronizada e
marcado para sítios de combinação disponível.
WESTERN BLOT – WB
A técnica de Western Blotting, é uma ferramenta de
grande utilidade para a caracterização de antígenos, ou para
pesquisa de anticorpos específicos para um determinado
componente antigênico.
A técnica de WB baseia-se numa combinação de três
métodos:
A separação de macromoléculas através de eletroforese
em gel de poliacrilamida;
Sua transferência eletrolítica para membranas
(geralmente de nitrocelulose);
Ensaio de revelação.
Eletroforese em gel
As proteínas da amostra são separadas de acordo com o
peso molecular.
Transferência
A fim de fazer as proteínas acessíveis à detecção do
anticorpo, elas são movidas do gel para uma membrana de
nitrocelulose. A membrana é colocada face-a-face com o gel, e
uma corrente elétrica é aplicada entre grandes placas de cada
lado, então as proteínas carregadas se movem do gel para a
membrana enquanto mantém a mesma disposição que
continham no gel. Como resultado desse processo de
"borramento" as proteínas são expostas a uma fina camada para
detecção.
Revelação / Bloqueio
Desde que a membrana foi escolhida por sua habilidade
de ligar proteínas, passos precisam ser feitos para impedir as
interações não específicas entre a membrana e o anticorpo
usado para a detecção da proteína alvo.
Métodos de dois passos
Anticorpo primário: Anticorpos são gerados quando uma
espécie hospedeira ou uma cultura de células imunes são
expostos à proteína de interesse (ou a uma parte dela).
Normalmente uma parte da resposta imune é colhida e usada
como ferramenta de detecção específica e sensível que se liga
à proteína diretamente - por isso anticorpo primário.
Anticorpo secundário: Depois de se enxaguar a membrana
para remover o anticorpo primário não ligado, ela é exposta a
outro anticorpo, direcionado a porções espécies-específicas
do anticorpo primário. Este é conhecido como anticorpo
secundário. Ele geralmente é ligado a biotina ou a uma enzima
reveladora como por exemplo fosfatase alcalina. Esse passo
confere a vantagem de que vários anticorpos secundários se
ligarão a um anticorpo primário, providenciando um sinal
intensificado.
O teste confirmatório de HIV emprega um
Western blot para detectar o anticorpo anti-HIV
na amostra de soro humano. Proteínas de
células conhecidas infectadas com o HIV são
separadas e "blotadas" em uma membrana
como acima. Então, no soro a ser testado é
aplicado o anticorpo primário no passo de
incubação; o anticorpo livre é lavado, e um
anticorpo anti-humano secundário é ligado, e
uma enzima reveladora é adicionada. As bandas
impregnadas então indicam os anticorpos do
soro dos pacientes marcados com o anticorpo
anti-humano.
Um Western blot também é um teste definitivo
para a doença da vaca louca.
Algumas formas do teste da Doença de
Lyme empregam o Western blot.
NUNCA É DEMAIS APRENDER.
NUNCA É DEMAIS ENSINAR.