Biologia Celular e molecular
Purificação e Caracterização do
anticorpo anti-DRG 11b
Orientador: Prof. Dr. Carlos Reguenga
Autores: Ana Filipa Pereira
Liliana Sofia Coelho
DRG11
• O Drg11 é um factor de transcrição,
expresso nos gânglios raquidianos e no
corno dorsal da espinal medula, durante a
vida embrionária (a expressão do drg11
decai após o nascimento).
• Drg11 participa no desenvolvimento de
neurónios envolvidos no processamento
da sensação dolorosa.
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Sistema Nociceptivo
Gânglio dorsal → Corno dorsal
Produção da resposta.
Nervo sensorial leva a
informação à espinal
medula.
Percepção do estímulo
pelo órgão receptor
3
Organização genómica
Gene drg11 → cromossoma 14
47,5 Kb
Drg11 gene
DRG11
DRG11b
DRG11
N
263 a.a.
Ligação ao DNA
DRG11b
220 a.a.
N
C
homeodomain
homeodomain
Regulação
C
4
DRG11
MFYFHCPPQLEGTAPFGNHSTGDFDDGFLRRKQRRNRTTFTLQQLEALEAVFAQTHYPDVFTREELA 67
DRG11b
MFYFHCPPQLEGTAPFGNHSTGDFDDGFLRRKQRRNRTTFTLQQLEALEAVFAQTHYPDVFTREELA 67
*******************************************************************
DRG11
MKINLTEARVQVWFQNRRAKWRKTERGASDQEPGAKEPMAEVTPPPVRNINSPPPGDQTRSKKEAL 133
DRG11b
MKINLTEARVQVWFQNRRAKWRKTERGASDQEPGAKEPMAEVTPPPVRNINSPPPGDQTRSKKEAL 133
******************************************************************
DRG11
EAQQSLGRTVGPTGPFFPSCLPGTLLNTATYAQALSHVASLKGGPLCSCCVPDPMGLSFLPTYGCQ 199
DRG11b
EAQQSLGRTVGPTGPFFPSCLPGTLLNTATYAQALSHVASLKDHFRAMLCSGSFGFRGEQTQQRAL 199
******************************************
*
DRG11
SNRTASVAALRMKAREHSEAVLQSANLLPSTSSSPGPASKQAPPEGSQDKTSPTKEQSEGEKSV 263
DRG11b
TPNLYPFLIDERCSAVDMTQG------------------------------------------- 220
O anticorpo anti-drg11b foi criado usando um péptido de 15 a.a..
Este foi escolhido na sequência da drg11b que difere da drg11.
5
O anticorpo foi produzido com a
finalidade de se poder estudar o
papel da proteína drg11b nos
mecanismos de processamento da
dor.
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Objectivo
Purificar e testar o anticorpo anti-DRG 11b.
Ferramenta para estudar o papel do drg11b no
desenvolvimento do sistema nociceptivo.
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Material Inicial
Soro de coelhos imunizados com o péptido
(FGFRGEQTQQRALTP)
específico do Drg11b.
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1.
Purificação do anticorpo
• Cromatografia por afinidade
Baseia-se na interacção do anti-drg11b com o
péptido ligado a uma resina
Lavagens da resina-péptido drg11b
Incubar com o soro “overnight”
Separação do sobrenadante
Montagem da coluna
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Eluição por choque de pH
(pH 3.0)
Recolha de 10 fracções
com bomba peristáltica
Neutralização com Tris
(pH=8.0)
10
2.
Testar o anticorpo
• Dot blot
Colocamos o péptido DRG11b numa
membrana de nitrocelulose
Colocamos as membranas numa solução de
bloqueio
Incubamos com o anticorpo purificado
overnight
Incubamos com o anticorpo secundário
conjugado com a fosfatase alcalina
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Revelação com substratos
Resultado
12
Soro
11
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Soro após resina
Conclusão: o anticorpo encontrava-se maioritariamente presente nas fracções
3 e 4.
12
2.
Testar o anticorpo
O anticorpo foi posteriormente testado por
imunocitoquímica.
Não foram obtidos resultados positivos.
Concentrar o anticorpo.
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3.
Concentração do anticorpo
• As imunopurificações foram repetidas várias vezes
e as fracções 3 e 4 misturadas.
• Colocou-se a solução final num centricon (tubo
com uma membrana que retém proteínas maiores
que 30 kDa).
• Centrifugação a 2500 rpm.
25KDa
50 KDa
150 KDa
14
4.
Testar o anticorpo concentrado
•Imunocitoquímica
Usaram-se lâminas com cortes de embrião
E13.5 e E16.5 de ratinhos wild-type
Desparafinação (banhos em soluções de
xilol, de seguida concentrações
decrescentes de etanol e por fim água).
Bloqueio com soro
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Incubaram-se os cortes com o anticorpo
primário (anti-DRG 11b) e como controlo
positivo com anti-drg11
Incubaram-se com anticorpo secundário
conjugado com um fluorocromo vermelho
Observaram-se os locais de expressão da
proteína usando microscopia de
fluorescência
16
E13.5
Anti-Drg11b
E13.5
E16.5
Anti-Drg11
(reconhece Drg11 e Drg11b)
É possível que o anticorpo não tenha reconhecido a
proteína pelo o facto do epítope poder estar
mascarado pelo folding da proteína.
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• Western-blotting com extractos de
medula espinal de embriões
1. Preparação da electroforese em gel
de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 10%.
2. Preparação das amostras de medula
espinal com idades (embrionárias e
pós-natais)diferentes.
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3. Colocaram-se as soluções nos poços formados
pelo pente no gel, como esquematizado abaixo.
M
a
r
c
a
d
o
r
E15
E18
P7
P14
E15
E18
P7
P14
Marcador: contem uma mistura de proteínas de tamanho
conhecido.
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5. No final da electroforese,
transferiram-se as proteínas
do gel para uma membrana
de nitrocelulose.
6. Cororou-se com Panceau S.
97kDa
66kDa
7. Incubaram-se com o antidrg11 (reconhece tanto
drg11 como drg11b) e com o
45kDa
anticorpo anti-drg11b
concentrado.
8. Revelação pelo método
quimioluminescente
31kDa
21kDa
Anti-drg11
Anti-drg11b
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Conclusão quimioluminescência
Não foram obtidos resultados. O anticorpo não tem
sensibilidade suficiente para detectar o Drg11b por
métodos desnaturantes.
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Com este conjunto de experiências
podemos concluir que o anticorpo
não é funcional.
Ponderações
 O anticorpo só reconhece a proteína apenas em grandes
quantidades (resultado do dot blot).
 O anticorpo não tem sensibilidade para detectar a proteína
com os métodos utilizados.
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Perspectivas futuras
•
Produção
de
uma
proteína
recombinante
correspondente à parte C-terminal específica do Drg11b de
modo a produzir um novo anticorpo.
•
Imunoprecipitação das bandas reconhecidas pelo antiDrg11 e identificação por espectroscopia de massa (MALDI-MS).
•
Experiências de hibridação “in situ” com
específicas para o exão de cada uma das isoformas.
sondas
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Agradecimentos
• Professor Doutor Carlos Reguenga
• Laboratório Biologia Celular e Molecular
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