Departamento de Bioquímica
Instituto de Química – USP
EXERCÍCIOS
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
QBQ 0316N
2015
Professores
Carlos T. Hotta
Ronaldo B. Quaggio
1
1.
Um extrato de proteínas foi obtido a partir da lise de leveduras. Para se quantificar a
quantidade de proteínas neste extrato, foi utilizado o reagente de Bradford. Junto com suas
amostras, duas curvas-padrão foram geradas medindo-se a Absorbância em 595 nm em
amostras incubadas com o reagente de Bradford por 8 min. Os dados abaixo são das
Absorbâncias subtraídas do Branco.
a) Qual a função do Branco?
b) Qual dos dois gráficos é mais adequado para se utilizar como uma curva-padrão?
Justifique
c) Qual a unidade de concentração de proteína que será obtida?
d) Qual é a maior e a menor absorbância que a curva-padrão consegue medir com
confiança? Qual é a concentração de proteínas nestas absorbâncias?
e) Digamos que sua amostra teve uma absorbância de 1.7, a concentração obtida usando
a curva-padrão é confiável? Como solucionar este problema?
f) As absorbâncias abaixo foram obtidas com uma mesma amostra diluída em
concentrações diferentes. Calcule a concentração da amostra sem diluir.
Diluição 5x
Diluição 50x
Diluição 100x
Diluição 500x
Abs 595 nm
1.8
1.25
0.64
-0.05
2
2.
O ácido dinitrosalicílico (DNS) pode ser usado para medir a quantidade de açúcares
redutores em amostras, pois a reação deste com o grupo aldeído livre presente no carbono 1
das aldoses, ou com o grupo cetônico presente em frutoses, libera um produto que absorve luz
à 540 nm. Alunos de um curso de bioquímica, montaram a seguinte curva padrão usando uma
solução de glicose 5 mM (massa molar = 180 g) e obtiveram os seguintes resultados após
ferver as amostras por 10 min:
Glicose 5 mM
Água
Reagente DNS
Concentração de
Abs 540 nm
(µl)
(µl)
(µl)
glicose (µg/ µl)
0
500
500
0,010
50
450
500
0,100
100
400
500
0,250
150
350
500
0,380
200
300
500
0,480
250
250
500
0,620
300
200
500
0,680
350
150
500
0,820
400
100
500
0,940
450
50
500
1,100
500
0
500
1,220
O reagente da Glicose Oxidase (TGO) pode ser usado para medir especificamente a quantidade
de glicose presente em uma amostra. A glicose oxidase, ao oxidar glicose, reduz um grupo
NAD+ para NADH. Essa reação pode ser acoplada à oxidação de um grupo como a o-dianisidina,
a qual passa a absorver luz a 420nm ao ser oxidado. Foi montada uma curva padrão com uma
solução de glicose 0,5 mM e, após incubar a amostra por 1 h a 37°C para ocorrer a reação
foram obtidos os seguintes resultados:
Glicose 0,5 mM
Água
Reagente TGO
Concentração de
Abs 420 nm
(µl)
(µl)
(µl)
glicose (µg/ µl)
0
500
500
0,020
50
450
500
0,120
100
400
500
0,200
150
350
500
0,270
200
300
500
0,390
250
250
500
0,510
300
200
500
0,620
350
150
500
0,660
400
100
500
0,780
450
50
500
0,910
500
0
500
0,980
O reagente Fenol-Sulfúrico (FS) pode ser usado para medir a quantidade de açúcares presentes
em uma amostra, pois após a hidrólise pelo ácido sulfúrico e a reação do fenol com os grupos
hidroxila é gerado um produto que absorve a 490 nm. Foi montada a curva padrão abaixo com
uma solução de glicose 1 mM e após a reação foram obtidos os dados abaixo:
3
Glicose 1 mM
(µl)
0
10
20
50
100
150
200
250
300
400
Água
(µl)
400
390
380
350
300
250
200
150
100
0
Reagente FS
(µl)
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
Concentração de
glicose (µg/ µl)
Abs 490 nm
0.001
0.050
0.075
0.175
0.450
0.600
0.750
0.990
1.150
1.600
Diferentes variedades de cana-de-açúcar foram testadas para saber qual das variedades possui
a maior quantidade de açúcares solúveis, o que é de grande interesse para a indústria
açucareira. Pedaços do colmo da cana-de-açúcar foram homogenizados em água e este
material foi centrifugado por 10 min a 10.000 g a 4°C. O sobrenadante foi diluído e usado para
determinação de açúcares com os métodos do ácido dinitrosalícilico (DNS), glicose oxidase
(TGO) e fenol-sulfúrico (FS), utilizando-se os mesmos volumes das respectivas curvas-padrões.
Os resultados estão expostos na tabela abaixo:
Variedade
Massa de
Volume
Diluição
Amostra
Abs
Abs
Abs
tecido (g)
final (ml)
(X)
(µl)
540 nm
420 nm
490 nm
(DNS)
(TGO)
(FS)
1
10
10
100
100
0,001
0,003
0,812
2
5
10
20
100
0,005
0,001
1,525
3
7
10
30
100
0,003
0,002
1,210
4
2
10
5
100
-0,002
-0,009
0,994
5
25
10
200
100
-0,010
0,001
0,853
6
12
10
100
100
0,000
0,007
1,112
7
8
10
100
100
0,001
-0,008
1,215
8
10
10
100
100
0,003
-0,001
1,336
9
4
10
15
100
0,002
0,001
1,201
10
1
10
2
100
-0,008
0,002
1,487
a)
Qual das técnicas é a melhor para se medir açúcares solúveis em cana-de-açúcar?
Como você explicaria esses resultados?
b)
Calcule a concentração de açúcares solúveis nos diferentes homogeneizados e a massa
de açúcar que pode ser obtida por massa de tecido vegetal (g açúcar/ g tecido. Qual das
plantas é a melhor para a produção de sacarose?
c)
Uma indústria farmacêutica está interessada na produção de alfa-glicosidase de
levedura para geração de glicose e frutose a partir de açúcar da cana (sacarose). Para tal,
obteve várias linhagens de levedura e agora há a necessidade de medir a atividade de alfaglicosidase presente nas células. Quais das técnicas – DNS, TGO ou FS – você usaria para medir
a atividade dessa enzima, usando sacarose como substrato? Considere fatores como
sensibilidade e tempo de medição.
4
3.
A indústria farmacêutica preparou lisados de levedura de diferentes linhagens. Em
todas as amostras usou 1 g de células e obtiveram 10 mL de lisado. Esses lisados foram
utilizados para ensaios enzimáticos, empregando p-nitrofenil α-glicosídeo (pNPαglc) como
substrato. Foram obtidos os resultados a seguir:
linhagem
A
B
C
D
E
F
diluição
lisado
diluído (µl)
100x
50x
8x
70x
500x
200x
Use a equação da reta
protocolos).
100
20
50
200
200
200
Abs420nm =
água
(µl)
pNPαglc
(µl)
Abs420 nm Abs420 nm
(15 min) (30 min)
Abs420 nm Abs420 nm
(45 min) (60 min)
100
200
0,050
0,100
0,150
0,200
180
200
0,080
0,160
0,240
0,320
150
200
0,250
0,500
0,750
1,000
0
200
0,100
0,200
0,300
0,400
0
200
0,010
0,020
0,030
0,040
0
200
0,075
0,150
0,225
0,300
0,0049 [p-nitrofenolato] + 0,014 (gráfico na apostila de
As mesmas amostras foram submetidas à determinação de proteínas com o reagente de
Bradford (comassie blue G), obtendo-se os dados a seguir:
linhagem
A
B
C
D
E
F
diluição
20x
50x
10x
20x
5x
80x
lisado diluído
(µl)
100
20
50
80
10
100
água (µl)
0
80
50
20
90
0
Reagente
Bradford (ml)
1
1
1
1
1
1
Abs595 nm
(15 min)
0,265
0,320
0,50
0,105
0,750
0,415
Confeccionou-se também uma curva padrão usando albumina de ovo:
Albumina
0,2 g/l (µl)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
água (µl)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Reagente
Bradford (ml)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Massa de
proteína (mg)
Abs595 nm
(15 min)
0,010
0,080
0,160
0,240
0,320
0,400
0,480
0,560
0,640
0,720
0,800
5
Calcule a concentração de atividade enzimática no lisado de cada uma das linhagens de
levedura. Calcule também a atividade obtida por grama de células. Calcule a concentração de
proteína em cada um dos lisados e a atividade específica de cada um dos materiais. Se o
próprio lisado for utilizado industrialmente como fonte de enzima, qual das linhagens é melhor
para produzir essa enzima em larga escala? Se for necessário purificar a enzima, qual das
linhagens é a melhor fonte? Justifique as respostas.
4.
A enzima COMT (catecol-O-metiltransferase) atua metilando o 4-hidroxi-estradiol, um
metabólito carcinogênico derivado da metabolização do estrogênio. Esta reação química é
uma importante etapa na detoxificação do 4-hidroxi-estradiol (um catecol), transformando-o
em 4-metoxi-estradiol (um guaiacol) como esquematizado na reação abaixo.
Guaiacol
Sabendo que mulheres que desenvolvem câncer de mama (do subtipo dependente de
estrogênio) frequentemente apresentam variantes desta enzima com atividade reduzida, uma
industria farmacêutica resolveu desenvolver um medicamento para mulheres contendo esta
enzima com o objetivo de ajudar a prevenir o surgimento ou a reincidência do câncer de
mama. Para purificar grandes quantidades desta enzima, os investigadores envolvidos no
desenvolvimento deste medicamento, obtiveram orgãos bovinos que sabidamente expressam
a COMT. O primeiro passo que antecedeu a purificação envolveu o preparo de lisados celulares
de cada orgão. Estes lisados foram submetidos aos dois ensaios descritos abaixo.
Ensaio de Bradford
Tabela 1 – preparo do lisado
orgãos
fígado
Glândulas mamárias (GM)
cérebro
Rins
Quantidade de tecido usada
20 g
12 g
17 g
6g
Volume do lisado obtido
25 ml
16 ml
23 ml
9 ml
O lisado original de cada órgão foi diluído 100X e usado segundo o protocolo da tabela abaixo
(Tabela 2). Após 5 minutos de incubação foi lida a absorbância a 595nm e os resultados foram
também registrados na Tabela 2.
6
Tabela 2 – Quantificação da concentração de proteínas
L100X
(µL)
10
20
30
40
tubos
branco
fígado
GM
cérebro
rins
H2O
(µL)
100
90
80
70
60
reagente de
Bradford (mL)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
A595
0,003
0,382
0,686
0,838
0,813
Para este experimento, a curva padrão com albumina forneceu o gráfico abaixo:
Absorbância a 595nm
Curva Padrão da Albumina
1.4
f(x) = 0.08x + 0.06
R² = 0.98
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
[Albumina] ug
Reação enzimática colorimétrica
Para medir a atividade da COMT, foi utilizado um ensaio colorimétrico usando-se os dois
substratos da COMT: o doador de grupos metil s-adenosil-L-metionina (SAM) e um substrato
artificial contendo um grupo catecol, que passa a apresentar um pico de absorção a 320nm
quando metilado. Os lisados originais de cada órgão foram diluídos 20X e usados para
monitorar a atividade enzimática segundo o protocolo da tabela abaixo (Tabela 3). Após
diferentes tempos de incubação a 37°C, a absorbância a 320 nm das amostras foi medida e
colocada na tabela 3.
tubo
1
2
3
4
Lisado
(ml)
0,2
0,2
0,2
0,2
SAM
(ml)
0,1
0,1
0,1
0,1
Substrato Tempo
artificial
(min)
(ml)
0,1
5
0,1
10
0,1
15
0,1
20
Fígado
(A320nm)
0,11
0,28
0,4
0,51
Cérebro GM
(A320nm) (A320nm)
0,04
0,09
0,15
0,19
0,06
0,12
0,2
0,25
Rins
(A320nm)
0,08
0,15
0,21
0,32
7
A curva padrão obtida para relacionar a quantidade de substrato artificial metilado da COMT
(produto) com a Absorbância a 320 nm é apresentada no gráfico abaixo:
Curva Padrão da atividade da COMT
0.7
Absorbância a 320nm
0.6
f(x) = 0.01x - 0.01
R² = 1
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
micromol de produto
Considerando os resultados experimentais acima, calcule para cada lisado:
a) a concentração de proteína (mg/mL).
b) a concentração da atividade enzimática (U/mL).
c) a atividade específica (U/mg de proteína).
Com base nos cálculos acima, qual é o melhor órgão a ser utilizado para se obter a maior
quantidade da COMT? E o melhor órgão para se obter a COMT mais pura? Justifique.
5.
Quatro amostras (1 a 4) foram submetidas à eletroforese em poliacrilamida
desnaturante (SDS-PAGE) na presença e na ausência de beta-mercaptoetanol, resultando nos
seguinte géis:
As distâncias de migração das bandas das proteínas no gel estão colocadas nas tabelas abaixo.
8
Gel em condições redutoras
Proteínas Padrão
azul de bromofenol
banda A
banda B
banda C
banda D
banda E
banda F
banda G
banda H
Distância (cm)
6,8
0,7
1,6
3,9
5,0
4,4
4,2
4,8
5,3
Gel em condições não-redutoras
Proteínas Padrão
azul de bromofenol
banda I
banda J
banda K
banda L
banda M
banda N
banda O
Distância (cm)
6,8
0,7
1,4
1,6
2,9
4,2
4,8
5,3
A curva gerada pelas proteínas padrão pode ser encontrada abaixo:
y = -1.3791x + 5.4958
R² = 0.9978
6
logPM
4
2
0
0
0.4
0.8
1.2
migração relativa
Responda:
a) Qual a função do SDS no SDS-PAGE?
b) Qual a razão das diferenças entre o gel com β-mercaptoetanol e sem βmercaptoetanol?
c) Qual o peso molecular de cada uma delas? Quais continham mais de uma subunidade
e qual o peso molecular de cada cadeia proteica?
5.
As figuras a seguir apresentam o perfil de eluição da atividade de alfa-glicosidase em
uma cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-celulose. Cada uma das cromatografias
9
foi realizada utilizando um tampão com pH diferente (9,0 – 8,0 – 6,0). Com base nos resultados
responda qual a provável faixa de valores do pI (ponto isoelétrico) desta alfa-glicosidase:
6.
Você conseguiu purificar uma celulase através da marcha de purificação a seguir.
1º passo: cromatografia de troca aniônica em pH 10.
2º passo: cromatografia de filtração em gel em pH 6,0.
Após cada passo os tubos que continham a atividade de celulase foram reunidos. Para este
material foi calculada a atividade enzimática total de celulase e também a quantidade de
proteína. A tabela abaixo resume estes resultados:
Passo
Atividade de
Atividade de
Proteína total Proteína total
celulase aplicada celulase recuperada
aplicada
recuperada
(U)
(U)
(mg)
(mg)
Troca iônica
500
100
1,0
0,05
Filtração em gel
100
80
0,05
0,02
Após cada cromatografia os tubos que continham atividade de celulase também foram
reunidos e analisados por SDS-PAGE em meio redutor:
10
SDS-PAGE de materiais recolhidos ao longo da marcha de purificação. M – meio de
cultura; T – material recuperado após cromatografia de troca aniônica; F – material
recuperado após cromatografia de filtração em gel; P – padrões de peso molecular.
Para a coluna de filtração em gel de 25 ml usada na marcha de purificação foi previamente
preparada uma curva de calibração utilizando proteínas de diferentes pesos moleculares. Os
dados obtidos estão descritos na tabela abaixo juntamente com o resultado para
cromatografia da celulase:
Material
Proteína padrão de 2.000.000 daltons
Proteína padrão de 66.000 daltons
Proteína padrão de 45.000 daltons
Proteína padrão de 12.400 daltons
Proteína padrão de 6.500 daltons
Atividade celulásica
a)
b)
c)
d)
Volume de eluição (ml)
7,53
9,38
10,46
13,70
16,22
9,58
Calcule a recuperação da atividade enzimática após cada um dos passos da purificação da
celulase.
Calcule a atividade específica da celulase após cada um dos passos da marcha de
purificação.
Qual dos passos é melhor na purificação desta enzima? Por quê?
Calcule a massa molecular da enzima determinada por SDS-PAGE e por filtração em gel.
Compare os valores e formule hipóteses para explicar os resultados.
11
7.
O tecido embrionário de fígado contém a enzima que catalisa a reação S -> P. O tecido
de fígado adulto também apresenta a atividade S -> P. Alguns dados cinéticos obtidos com
extratos dos dois tecidos são apresentados abaixo. Que conclusões você pode tirar com
relação à identidade das duas enzimas?
[S]
Velocidade inicial observada
(µmoles.mg de proteína-1.min-1)
[M]
Extrato de Fígado
Extrato de Fígado
Adulto (E1)
Embrionário (E2)
1,67 x 10-5
1,05
5,00
-5
2,50 x 10
1,54
6,66
3,33 x 10-5
1,98
8,00
5,00 x 10-5
2,86
10,00
7,00 x 10-5
3,78
11,67
1,00 x 10-4
5,00
13,33
1,50 x 10-4
6,67
15,00
-4
1,67 x 10
7,15
15,40
2,00 x 10-4
8,00
16,00
-4
3,00 x 10
10,00
17,10
Durante danos consideráveis do fígado, esta enzima é liberada na corrente sanguínea. Após
exercícios intensos, uma enzima de músculo, E3, que catalisa a mesma reação, é liberada na
corrente sanguínea. E1 e E3 podem ser diferenciadas facilmente porque apresentam
diferentes valores de Km (A Km da enzima de músculo é 2 x 10-5 M). Uma determinação com
uma amostra de sangue de um paciente apresentou os resultados dados na tabela abaixo:
[S] (M)
5,0 x 10-5
7,0 x 10-5
1,0 x 10-4
1,5 x 10-4
2,0 x 10-4
3,0 x 10-4
6,0 x 10-4
V (moles.ml de soro-1.min-1)
43
57
75
100
120
150
200
Sabendo que o paciente chegou inconsciente no hospital, de modo que você não pode fazer a
ele nenhuma pergunta, o paciente sofre de uma doença do fígado, ou simplesmente tem se
exercitado violentamente?
12